山药皮多糖超声辅助提取工艺及其抗氧化活性

马艳弘，殷剑美，魏建明，李亚辉，张宏志，张立群

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏南京210014；3.江苏博达生物科技有限公司，江苏徐州221723）

山药皮多糖超声辅助提取工艺及其抗氧化活性

马艳弘1，殷剑美2，魏建明3，李亚辉1，张宏志1，张立群3

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.江苏省农业科学院经济作物研究所，江苏南京210014；3.江苏博达生物科技有限公司，江苏徐州221723）

研究山药皮多糖的超声辅助提取工艺及其抗氧化活性。结果显示：山药皮多糖的最佳提取条件为料液比1∶20（g/mL）、超声时间110 min、提取时间40 min，提取温度70℃，在此条件下，多糖的提取率为185.12 mg/g，与未超声波辅助提取对照试验相比提高了48.89%，所提多糖具有较好的抗氧化活性，且在一定浓度范围内，其抗氧化能力与多糖质量浓度呈现一定的剂量效应关系。当质量浓度为3.2mg/mL时其对DPPH自由基和羟自由基清除率分别达到87.67%、71.20%。

山药皮；超声提取；多糖；响应面法；抗氧化性

山药为薯蓣科（Dioscorea opposite thumb.）一年或多年生蔓生草本植物的根茎，又名薯蓣、薯药、土薯等，广泛分布于热带和亚热带地区，目前已有品种600多种，为我国传统的药食同源两用食物。山药不仅富含淀粉、蛋白质、氨基酸、脂肪酸与多种矿质元素，还含有活性多糖、多酚、黄酮、皂甙、尿囊素、尿囊酸等多种生物活性成分［1］，具有极高的营养、经济价值和开发前景。山药多糖是其中最主要的生理活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗癌、保护肝脏、增强机体免疫力等多种药理保健功能［2-3］。市场以山药为原料加工的各种保健食品备受消费者的青睐。

山药皮为山药加工副产物，约占加工品的20%左右，目前只有少部分作为饲料廉价出售，而大部分作为废料直接丢弃，既容易造成环境污染又是对资源的极度浪费。已有研究表明：山药皮同样含有大量的活性成分，且其中总酚、总黄酮、尿囊素［4］含量远高于去皮山药，具有比去皮山药更高的药理保健功效。随着山药种植面积和加工量的不断提高，山药皮的产量也逐年增高，其开发利用已引起越来越多的关注。目前，山药皮的研究主要集中在皂苷、多酚等［5-6］方面，而有关山药皮多糖的高效提取技术与活性分析仍鲜见报道。

多糖的提取技术有热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法、酶法辅助法等，其中超声辅助提取技术因其具有操作简便、提取时间短、效率高、产物易提纯等优点而被广泛应用。因此，本研究以山药的加工废弃物山药皮为研究材料，采用超声辅助提取法提取其中多糖，通过响应面分析法优化超声提取工艺并探讨其抗氧化活性，为提高山药加工附加值、降低生产成本、保护生态环境、提高资源的综合利用率提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

山药皮：由江苏博达生物科技有限公司提供，为菜用山药加工副产物。将山药皮低温干燥，粉碎，过80目筛，密封、低温保藏备用。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由（DPPH）：上海源叶生物科技有限公司；羟自由基测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；苯酚、无水乙醇、98%硫酸、柠檬酸、盐酸、氯化钾、氯仿、正丁醇等均为分析纯试剂。

1.2仪器与设备

KH-500E超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；FDU-1200型冷冻干燥机：日本东京理化器械株式会社；FW100万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-5220型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器；E－poch微孔板分光光度计：美国Bio Tek公司；TDL-80-2C低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；ML204万分之一天平：梅特勒仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3方法

1.3.1山药皮多糖提取工艺

称取2 g山药皮干粉，按照一定的料液比（g/mL）加蒸馏水混合，置于超声波清洗仪，在超声功率500 W条件下、超声辅助提取不同时间，再于不同温度下静置提取不同时间，然后离心过滤，滤渣再提取1次，合并滤液，减压旋蒸浓缩后，用4倍体积的80%乙醇（体积）沉淀静置过夜，次日3 500 r/min离心15 min，无水乙醇洗涤即可得山药皮粗多糖。粗多糖再经Sevag法脱蛋白处理，旋转蒸发仪浓缩、4倍体积80%乙醇沉淀、离心、干燥即可得山药皮粗多糖。

1.3.2多糖提取率的测定

以葡萄糖作标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，根据测定结果绘制标准曲线，所得线性回归方程为：C=0.997A-0.000 6，R2=0.999 3，（式中C为葡萄糖质量浓度，A为吸光度）。据标准曲线，计算样品多糖含量。再根据如下公式计算多糖提取量。

1.3.3单因素试验设计

以多糖提取量为考察目标，500 W超声功率，分别考察料液比、超声时间以及提取时间、提取温度对多糖提取量的影响。固定提取时间1 h、超声时间1 h、提取温度50℃，考察不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对多糖提取量的影响；固定料液比1∶15、提取时间1 h、提取温度50℃，考察不同的超声时间（80、90、100、110、120、130 min）对多糖提取量的影响；固定料液比1∶15（g/mL）、超声时间1 h、提取时间1 h，考察不同的提取温度（30、40、50、60、70、80℃）对多糖提取量的影响；固定料液比1∶15（g/mL）、超声时间1 h、提取温度50℃，考察不同的提取时间（20、40、60、80、100、120 min）对多糖提取量的影响。

1.3.4Box-Behnken试验设计及响应面分析

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计方案［7］，以料液比、提取时间、提取温度、超声时间为考察因素，以多糖提取量为响应值，利用Design-Expert 8.05 b软件优化山药皮多糖提取工艺。试验因素、水平编码见表1。

表1　Box-Behnken试验设计因素和水平编码表Table 1Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5山药皮多糖抗氧化活性分析［8-9］

1.3.5.1山药皮多糖对DPPH自由基清除能力测定

配置0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL的多糖溶液和相应浓度的VC溶液，各取2 mL于具塞试管中，每管加入2×10-4mol/L DPPH溶液2 mL，摇匀后避光放置30 min。分别测定517 nm处的吸光度。试验设空白组、对照组、试验组。DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.5.2山药皮多糖清除羟自由基能力测定

分别取500 μL不同质量浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL）的多糖溶液和VC溶液，按试剂盒说明书操作，测定吸光度A值。其呈色与·OH的多少呈正比关系，即吸光度越小，样品对·OH的清除能力越强。羟氧自由基抑制能力计算公式如下：

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.4数据分析

利用SPSS18.0和Design-Expert V8.0数据处理软件进行数据处理即统计分析。

2结果与分析

2.1山药皮多糖提取单因素试验结果

2.1.1料液比对山药皮多糖提取量的影响

料液比对山药皮多糖提取量的影响见图1。

图1　料液比对多糖提取量的影响Fig.1Effect of solid to liquid radio on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由图1可知，随着料液比的增加，多糖提取量逐渐增大，在料液比1∶20（g/mL）时，粗多糖提取率达到最大157.22 mg/g，但若料液比继续增大，多糖提取率呈现下降趋势，所以山药皮多糖提取适宜的料液比为1∶20（g/mL）。

2.1.2超声时间对山药皮多糖提取量的影响

超声时间对山药皮多糖提取量的影响见图2。

图2　超声时间对多糖提取量的影响Fig.2Effect of ultrasonic time on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由图2可知，随着超声时间的不断增加延长，多糖的提取量也不断提高，当超声时间达120 min时，多糖提取量达到175.42 mg/g，这是由于在一定时间范围内随着超声时间的延长，超声的空化效应增强，细胞遭受破坏，更多的胞内多糖溶入溶剂导致了多糖提取量的增高；超过120 min后提取量出现下降趋势，是由于长时间的冲击波作用引起了山药皮多糖的共价键断裂从而导致多糖分子的降解，致使提取量随之下降［10-11］，因此120 min为适宜的超声时间。

2.1.3提取温度对山药皮多糖提取量的影响

提取温度对山药多糖提取量的影响见图3。

图3　提取温度对多糖提取量的影响Fig.3Effect of extraction temperature on the yield of polysaecharides from Chinese yam peel

由图3可知，30℃～40℃之间，多糖提取量变化平缓；40℃～70℃之间多糖提取量随提取温度的升高而大幅升高，当提取温度达到70℃时，提取量达171.49 mg/g；70℃～80℃之间，多糖提取量基本趋于稳定，甚至呈现下降趋势。因此为节约能耗和防止高温导致多糖降解，确定70℃为最佳提取温度。

2.1.4提取时间对山药皮多糖提取量的影响

提取时间对山药皮多糖提取量的影响见图4。

图4　提取时间对多糖提取量的影响Fig.4Effect of extraction time on the yield of yam peel polysaecharides

从图4可知，提取时间为40 min时，多糖提取量达到最大值126.60 mg/g，大于40 min后提取量呈下降趋势。这是由于前期超声提取过程已经使绝大部分多糖溶出，因此后续继续延长提取时间并不能有效提高多糖提取量，所以选最佳提取时间为40 min。

2.2山药皮多糖提取条件响应面优化结果

2.2.1回归模型建立与显著性检验

采用Box-behnken设计方案，以多糖提取量为响应值，优化山药皮多糖超声辅助提取工艺，其试验结果见表2（实测值为3次平行试验结果平均值）。应用Design Expert软件对试验值进行多元回归分析，得到的回归方程：Y=176.86+7.77A+1.19B-2.01C-5.47D+ 5.15AB-8.11AC+3.45AD+5.70BC+2.25BD-7.38CD-19.71A2-13.04B2-20.63C2+2.77D2

表2　Box-Behnken试验设计及结果Table 2Box-Behnken experimental design and results

对模型方程进行显著性分析结果见表3。

由表3可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项（P=0.429 9）不显著，实际试验值与预测值具有高度相关性（R2=0.986 2，R2Adj=0.972 4），表明模型与试验值拟合良好［12］，该模型可以对山药皮多糖的提取量进行准确的预测和分析。由表3还可知，4个自变量对响应值的影响程度大小依次为液料比（A）＞超声时间（D）＞提取温度（C）＞提取时间（B），其中因素A、C、D以及4个因素的二次项对山药皮多糖提取量影响显著（P＜0.01或P＜0.05），AD的交互作用对响应值的影响显著（P＜0.05），AB、AC、BC、CD的交互作用对响应值的影响极显著（P＜0.01）。说明4个因素均不同程度的对响应值产生影响，本试验设计的因素选择科学合理。

表3　方差分析表Table 3The table of variance analysis

2.2.2多糖提取量响应面分析与优化

图5反映了当液料比、超声时间、提取温度、提取时间4个因素中任意两个变量取零点水平时，其他两个因素的交互作用对山药皮多糖提取量的影响情况。曲面的陡度程度可以表明变量对多糖的影响程度［13］。

由图5可见，除提取时间与超声时间的交互作用对提取量的影响不显著（P＞0.05）外，其他因素两两之间交互作用对提取率的影响均显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。通过软件分析得到山药皮多糖最佳提取条件为：料液比1∶20.45（g/mL）、提取时间40 min、提取温度71.1℃，超声时间110 min，在此条件下山药皮多糖提取量的预测值为185.58 mg/g。为操作方便，修正最佳提取工艺条件为：料液比1∶20（g/mL）、提取时间40 min、提取温度70℃，超声时间110 min。

2.2.3验证试验

图5　各两因素交互影响山药皮多糖提取量的响应面图Fig.5Response surface plot showing the effects of solid to liquid ratio，extraction time，extraction temperature，and ultrasonic time on the yield of polysaccharides from chinese yam peel

按照山药皮多糖最佳优化条件随即取样进行3次验证试验，并以未经过超声处理但其他条件相同的处理为对照，测定多糖提取量，结果发现未经超声处理的对照组山药皮多糖提取量为124.33 mg/g，最优工艺条件下山药皮多糖的提取量为185.12 mg/g，多糖提取量提高了48.89%，实测值与预测值相对误差仅为0.25%；说明该试验结果稳定、可靠，模型拟合良好，能够很好的反应山药皮中多糖的提取情况。

2.3山药皮多糖抗氧化活性分析

山药皮多糖的对DPPH自由基和羟自由基的清除能力见图6。

图6　山药皮多糖自由基清除能力Fig.6Radical scavenging capacities of polysaccharide from Chinese yam peel

如图6所示，在所设浓度范围内，DPPH自由基和羟自由基清除率随山药皮多糖质量浓度增加逐渐增强，当浓度达到3.2 mg/mL时，DPPH自由基清除率达87.67%，羟自由基清除率为71.20%，表明山药皮多糖具有较强的DPPH自由基清除能力，但其对羟自由基清除率明显低于同浓度下VC的自由基清除率。

3结论

超声波辅助提取技术是近年来广泛应用于活性多糖提取的新技术［14］。超声产生的空化效应可快速破坏植物细胞壁，增大目标产物与溶剂的接触，还具有效率高、能耗低、溶剂用量少等特点，因此本研究以山药加工副产物山药皮为原料，采用超声辅助法提取山药皮多糖，并在单因素试验基础上通过响应面分析法优化了山药皮多糖的最佳提取工艺，建立了可靠的预测模型，得到山药皮多糖最优超声辅助提取条件为：超声功率500 W，料液比1∶20（g/mL）、超声提取时间110 min，超声提取后静置提取40 min，提取温度70℃，连续提取2次。此条件下山药皮多糖的提取量为185.12 mg/g，与未超声处理的对照组相比多糖提取量提高了48.89%。通过DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力测试发现，超声提取的多糖具有较强的抗氧化活性，3.2 mg/mL的多糖溶液对DPPH自由基和羟自由基的清除能力分别达87.67%、71.20%。尤其是其对DPPH自由基清除能力，几乎与同浓度的VC的抗DPPH自由基清除能力相差无几。由此可见，本试验既为山药皮废弃资源的合理利用提供了很好的思路，也为山药皮多糖的工业化生产提供了试验依据。超声辅助技术提取山药皮多糖节能高效、环保，既可有效预防山药皮可能造成的环境污染，又能提高山药皮资源利用率和山药加工附加值。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Chinese Yam Peel and Its Antioxidant Activity

MA Yan-hong1，YIN Jian-mei2，WEI Jian-ming3，LI Ya-hui1，ZHANG Hong-zhi1，ZHANG Li-qun3
（1.Institute of Farm Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；2.Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3.Jiangsu Boda Biotechnology Co.，Ltd.，Xuzhou 221723，Jiangsu，China）

This present study focused on extraction of polysaccharides from Chinese yam peel by ultrasonic assisted method，and the antioxidant activity of polysaccharides from Chinese yam peels was also evaluated.The extraction conditions of polysaccharides were optimized using response surface methodology on the basis of single factor experiment.The DPPH radical scavenging capacities and hydroxyl radical（·OH）scavenging capacities were measured.Results showed that the optimal parameiers of ultrasonic extractin were solid/liquid ratio 1/ 20（g/mL），ultrasonic time 110 min，extraction time 40 min，extraction temperature 70℃.Under these conditions，the polysaccharides extraction rate reached 185.12 mg/g，increased by 48.89%compared with the control without ultrasonic assisted extration.The polysaccharides obtained possessed potent antioxidant activity，and the antioxidant activity of polysaccharides from Chinese yam peel was found in does dependent manner.Under the concentration of 3.2 mg/mL，the radical scavenging rate on DPPH and·OH were 87.67%，71.20%，respectively.

Chineseyampeel；ultrasonicextraction；polysaccharide；responsesurfacemethodology；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.009

2016-05-29

江苏省苏北科技发展计划项目（BN2014087）；江苏省农业科技自主创新资金（cx（16）1019）

马艳弘（1972—），女（汉），副研究员，博士，研究方向：食品发酵技术与农副产品资源综合利用。