裙带菜蛋白的提取工艺研究

冯建岭，刘海燕，王丽丽，韩晴，李迎秋

（1．威海市食品药品检验检测中心，山东威海264210；2．威海市产品质量监督检验所，山东威海264210；3．齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东济南250353）

裙带菜蛋白的提取工艺研究

冯建岭1，刘海燕2，王丽丽1，韩晴3，李迎秋3

（1．威海市食品药品检验检测中心，山东威海264210；2．威海市产品质量监督检验所，山东威海264210；3．齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东济南250353）

以裙带菜为原料，采用碱提法对裙带菜蛋白的提取工艺进行研究。通过控制单因素如料液比、pH、浸提温度、浸提时间，寻找合适的试验条件，并在单因素基础上进行正交试验，分析不同因素对裙带菜蛋白提取的影响，确定最佳提取工艺条件为：料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间3.5h，pH9。提取率可达84.85%。

裙带菜；蛋白；提取工艺

裙带菜（Undaria pinnatifida）又名海芥菜、裙带，主要生长在暖温带海洋中，美味可口，营养价值丰富，被称为微量元素和矿物质的“天然宝库”［1］。此外，裙带菜能帮助人体清除肠道内的毒素，有助于人体的正常发育，提高免疫功能，还具有降低血压和增强血管弹性等作用［2-3］。日本是世界公认的长寿国，其中主要原因之一就是裙带菜每天必上餐桌，裙带菜目前已成为日本、韩国儿童和学生营养配餐的必备菜肴。在我国，虽然裙带菜分布广、产量高、资源丰富，但是利用率比较低。

裙带菜中含有人体必需的八种氨基酸［4］，是一种优良的蛋白质来源，但目前在加工过程中，裙带菜蛋白质资源浪费现象严重。因此，为充分利用裙带菜中营养成分，提高裙带菜蛋白提取率，本研究采用碱提法，对裙带菜蛋白的提取工艺进行探索，并做正交实验进行优化［5］。这将有助于加深人们对裙带菜的了解，同时有助于研究裙带菜的活性成分及其药理活性构效关系，具有重要的应用价值和现实意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

裙带菜：购买于威海宝河海藻生物有限公司；

氢氧化钠（分析纯）：购买于北京索莱宝科技有限公司；

牛血清蛋白：购买于上海伯奥生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

LG10-2.4A型高速离心机：北京京立离心机有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PB-10型酸度计：赛多利斯科学仪器有限公司；DK-98-ⅡA数显恒温水浴锅：金坛市金南仪器厂；101-3型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；Kjeltec 8100凯氏定氮仪：瑞典福斯分析仪器厂。

1.3方法

1.3.1裙带菜的预处理

首先用清水将新鲜的裙带菜冲洗干净，去除相应杂质，然后用电热鼓风干燥箱（45℃）进行干燥，经粉碎机打碎，最后过100目筛制成裙带菜粉，备用。

1.3.2蛋白质标准曲线的制定［6-7］

采用牛血清蛋白作为标准蛋白，制定蛋白浓度标准曲线。准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液。取9支干净的试管，编号为1～9，分别向其中加入标准蛋白质溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，再加入去离子水4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL，混合均匀。选用光程1 cm的适应比色杯，在278 nm波长处分别测定各试管溶液的吸光度（A278nm）。

1.3.3裙带菜蛋白提取率的计算［8］

蛋白质提取率/%=m0/m1×100

式中：m0为上清液中蛋白质的含量=（v×y×n）/ 1 000，单位为g；m1为裙带菜粉中蛋白质的含量（17.957 6%，由凯氏定氮法而得，本部分略），g；y= 0.576 9x+0.001 8（由标准蛋白曲线所得）；v为裙带菜溶液体积（mL）；n为稀释倍数。

1.3.4裙带菜蛋白的提取

1.3.4.1单因素试验

1）料液比对裙带菜蛋白提取的影响

准确称取5份裙带菜粉各2 g，分别加入5个250 mL的烧杯中，配制成料液比为1∶10、1∶15、1∶ 20、1∶25、1∶30（g/mL）的样液，调节pH值为8.5，置于50℃水浴3 h，6 000 r/min离心10 min。分别取上清液，用紫外可见分光光度计测量吸光度（278 nm），计算裙带菜蛋白提取率，试验重复3次，结果取平均值。

2）pH对裙带菜蛋白提取的影响

准确称取5份裙带菜粉各2 g，分别加入5个250 mL烧杯中，配成料液比为1∶20（g/mL）的样液，分别将样液的pH值调至7、7.5、8、8.5、9、9.5，然后在50℃条件下水浴浸提3 h，配平后离心10 min（6 000 r/min）。分别取1 mL上清液，在278 nm波长下用紫外可见分光光度计测吸光度，计算裙带菜蛋白提取率，做3组平行实验，结果取平均值。

3）浸提温度对裙带菜蛋白提取的影响

准确称取6份裙带菜粉各2 g，加入6个250 mL烧杯中，配成料液比为1∶20（g/mL）的样液，调节pH值为9.5，分别在30、35、40、45、50、55℃条件下水浴3 h，于6 000 r/min离心10 min。分别取1 mL上清液，用紫外可见分光光度计测吸光度（278 nm），计算裙带菜蛋白提取率，试验重复3次，数据取平均值。

4）浸提时间对裙带菜蛋白提取的影响

准确称取8份裙带菜粉各2 g，分别加入8个250 mL烧杯中，配成料液比为1∶20（g/mL）的样液，调节pH值至9.5，在50℃水浴条件下，分别浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h后配平离心10 min（6 000 r/min），再各取1 mL上清液，用紫外可见分光光度计测量278 nm波长处的吸光度，计算裙带菜蛋白质提取率，试验重复3次，取平均值。

1.3.4.2工艺优化实验（正交试验）

在单因素试验的基础上，对影响裙带菜蛋白提取的料液比、pH值、浸提温度、浸提时间进行L9（34）正交试验。因素与水平设计如表1所示。

表1　试验因素与水平Table 1Levels and factors of experiment

其中料液比分别取1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），pH值取8、8.5、9，浸提温度取40、50、55℃，浸提时间取2.5、3、3.5 h。

2结果与分析

2.1蛋白质标准曲线

根据标准蛋白溶液在278 nm波长的吸光度，绘制蛋白质标准曲线如图1所示，得线性公式y=0.576 9x+ 0.001 8，R2=0.999 9。

图1　蛋白质标准曲线Fig.1Standard curve of protein

2.2单因素试验结果与分析

2.2.1料液比对裙带菜蛋白提取率的影响

保持其他条件不变，不同料液比对裙带菜蛋白提取率的影响如图2所示。

图2　料液比对裙带菜蛋白提取率的影响Fig.2Effects of ratio of solid to liquidon on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

从图2可以发现，最初随着料液比的减小，蛋白质提取率增加，当料液比为1∶10（g/mL）时，蛋白质提取率是69.29%，料液比为1∶20（g/mL）时，提取率上升至77.22%。再往后，随着料液比的减小，提取率又发生下降，从1∶25（g/mL）～1∶30（g/mL），裙带菜蛋白质提取率基本在71%左右。而在食品工业生产过程中，如果料液比降低，酸沉蛋白时乳清中溶解的球蛋白量会增大［9］，蛋白的损失量也就增加，成品的得率反而下降，并且料液比太小会增加后处理的负担，使产品成本增大，因此碱液提取裙带菜蛋白时，较适宜的料液比为1∶20（g/mL）。

2.2.2pH值对裙带菜蛋白提取率的影响

pH值对裙带菜蛋白提取率的影响结果见图3所示。

由图3可知，随pH值的增大，裙带菜蛋白的提取率先变大后减小。在pH值从7增加到8.5时，蛋白质提取率从54.11%增加到79.55%，而当pH值大于8.5时，蛋白质提取率却呈下降趋势，pH值为9时，蛋白提取率下降至73.35%，可能原因是在受到强碱影响后，蛋白质发生变性。因此，最佳pH值应该控制在8.5，此时蛋白提取率高而且不会影响蛋白质的性质。

图3　pH值对裙带菜蛋白提取率的影响Fig.3Effects of pH on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

2.2.3浸提温度对裙带菜蛋白提取率的影响

以裙带菜蛋白提取率为指标，保持其他条件不变，浸提温度对裙带菜蛋白提取率的影响如图4所示。

图4　浸提温度对裙带菜蛋白提取率的影响Fig.4Effects of leaching temperature on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

从图4可以看出，浸提温度的高低对裙带菜蛋白提取率有较大影响，在一定阶段，随着温度的升高，裙带菜蛋白就越容易溶解出来，提取率就越高。当温度为30℃时，蛋白提取率为71.99%，40℃时提取率已上升至75.77%，当温度升至50℃时，蛋白提取率达到80.01%，而当温度超过50℃时，蛋白提取率又迅速下降，55℃时，提取率已降为75.54%，温度过高，蛋白开始发生变性。因此，应将浸提温度控制在50℃，才能得到最佳裙带菜蛋白提取率。

2.2.4浸提时间对裙带菜蛋白提取率的影响

通过单因素实验，浸提时间对裙带菜蛋白提取率的影响如图5所示。

图5　浸提时间对裙带菜蛋白提取率的影响Fig.5Effects of leaching time on extraction ratios of Undaria pinnatifida protein

由图5得知，在一定范围内，碱提时间越长，蛋白质提取率越高，达到一定时间后，提取率变得基本平稳。其中，浸提时间在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h时，蛋白提取率分别为65.13%、66.46%、67.35%、70.44%、77.08%、78.22%、77.85%、77.56%。另外，在较高pH值或温度下提取蛋白质，延长时间会使裙带菜蛋白的水解程度加深，而且会增加成本，所以对于提取时间要综合考虑。因此，选择浸提时间在3 h时，便可以得到较高的蛋白提取率。

2.3正交试验结果与分析

以裙带菜蛋白提取率为指标，通过L9（34）正交试验，确定最佳提取条件如表2所示。

表2　L9（34）正交试验设计及结果Table 2Design and result of the orthogonal experiment

由表2可以看出，通过正交实验和极差分析，各因素对裙带菜蛋白提取率影响的主次关系依次为A＞C＞D＞B，即料液比＞浸提温度＞浸提时间＞pH值，最优组合是A2C2D3B3，从而得出裙带菜蛋白最佳提取工艺条件：料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间3.5 h， pH 9。

2.4验证试验

通过正交试验得知，最佳工艺条件A2C2D3B3不在正交实验的9组实验中，因此在A2C2D3B3（料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间3.5 h，pH 9）条件下进行一次验证实验，测得裙带菜蛋白提取率可达84.85%。

3结论

通过单因素和正交试验对裙带菜蛋白提取工艺进行优化，研究结果表明，影响裙带菜蛋白的提取率的因素的主次关系依次为料液比、浸提温度、浸提时间、pH值，碱溶法提取裙带菜蛋白的最佳工艺条件为：料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间3.5 h，pH 9。在此条件下，裙带菜蛋白的提取率可以达到84.85%，大大提高资源利用率，能够拓展裙带菜蛋白在产品中的应用。

［1］刘元林.水产世界［M］.山东科学技术出版社，2007：114-115

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Study on the Extraction Process of Undaria pinnatifida Protein

FENG Jian-ling1，LIU Hai-yan2，WANG Li-li1，HAN Qing3，LI Ying-qiu3
（1.Weihai Center for Food and Drug Inspection，Weihai 264210，Shandong，China；2.Product Quality Supervision and Inspection of Weihai，Weihai 264210，Shandong，China；3.College of Food Science& Engineering，Qilu University Of Technology，Jinan 250353，Shandong，China）

Undaria pinnatifida as raw material，this experiment adopted alkali formulation to study extraction process of Undaria pinnatifida protein.Suitable experimental conditions were found by controlling single factors，such as ratio of solid to liquid，pH，leaching temperature，and leaching time.Moreover，orthogonal experiment was in process on the basis of single factors to analyze the effects of different factors on extraction of Undaria pinnatifida protein.The optimal process conditions were ratio of solid to liquid 1∶20（g/mL），leaching temperature 50℃，leaching time 3.5h，pH 10，and extraction ratio was 84.85%.

Undariapinnatifida；protein；extractionprocess

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.013

2015-05-03

冯建岭（1989—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学。