恩诺沙星可视化凝胶柱快速免疫检测方法研究

生威，吴雪宁，胡高爽，李诗洁，刘越，张燕，王硕

（教育部食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

恩诺沙星可视化凝胶柱快速免疫检测方法研究

生威，吴雪宁，胡高爽，李诗洁，刘越，张燕，王硕*

（教育部食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

建立一种动物源性食品中兽药恩诺沙星可视化凝胶柱快速免疫检测新方法。采用活化酯法制备恩诺沙星与辣根过氧化氢酶（HRP）的偶联物作为酶标抗原。整个检测在一个标准的1 mL SPE固相萃取柱中进行，柱中包含两层：一个结合了恩诺沙星特异性抗体的凝胶检测层和一个结合了HRP抗体的凝胶质控层。将样品提取液与酶标抗原预混合后加入到检测柱中，基于抗原抗体的竞争结合反应和辣根过氧化物酶的酶促反应，根据检测柱的检测层颜色的深浅和有无来定性半定量检测恩诺沙星的含量。该凝胶检测柱的检测限为5 μg/L，整个检测过程可以在10 min内完成，猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉和牛奶等动物源性食品中恩诺沙星检测限为100μg/kg。该方法具有准确、灵敏、特异性好、操作简便快速、成本低等优势，适合动物源性食品中恩诺沙星残留的快速筛查。

恩诺沙星；凝胶柱；可视化检测

恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）属于喹诺酮类抗菌药，作为广谱抗菌药，对支原体、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等均具有抗菌作用。恩诺沙星在畜牧和水产养殖中应用广泛，但是由于不科学地使用这类药物导致其在动物源性食品中残留，影响人类健康，使细菌的耐药性增强，进而影响药物在人类疾病治疗中的作用。目前用于检测动物源性食品中恩诺沙星残留的方法主要有微生物法［1］、高效液相色谱法［2-3］、液相色谱-质谱联用法［4-5］、毛细管电泳法［6-7］、免疫分析法［8-10］等。仪器分析法灵敏度高、准确性好，但检测仪器昂贵、检测步骤繁琐，不适合快速检测。免疫分析法特异性好、成本低、操作简单快速、结果判断容易，适合现场快速检测，特别是酶联免疫试剂盒［11-12］和胶体金试纸条［13］检测方法已经在兽药残留检测中得到了广泛应用。本研究旨在建立一种新型可视化免疫层析凝胶检测柱用于动物源性食品中恩诺沙星残留的快速检测。

1材料与方法

1.1药品与试剂

恩诺沙星等喹诺酮类兽药：德国Dr公司；辣根过氧化物酶、过氧化氢脲、3，3，5，5－四甲基联苯胺（TMB）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N’-二环已基碳二亚胺（DCC）、二甲基甲酰胺（DMF）、Tris、甘氨酸、Proclin 300抑菌素：美国Sigma公司；β-环糊精、二甲基亚砜（DMSO）：德国Merck公司；CNBr-Sepharose 4B溴化氰活化琼脂糖凝胶：美国GE公司；HPR抗体：北京庄盟生物技术公司；碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氢氧化钠、冰醋酸、盐酸、柠檬酸、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

超纯水系统：美国Millipore公司；分析天平-BL610：德国赛多利斯公司；周转式振摇器-MS2：美国IKA公司；旋涡混合器-HQ-60：北方同正生物技术发展公司；烧结玻璃过滤器：天津盛博玻璃仪器有限公司；SPE柱（1 mL）、聚乙烯垫片、转接头：美国Agilent Technologies公司。

1.3主要溶液

偶联缓冲液（pH 8.3）：NaHCO34.2 g，NaCl 14.6 g，双蒸水定容500 mL，用1 mol/L的NaOH调节其pH到8.3，4℃保存备用。封闭缓冲液（pH 8.0）：0.3 g甘氨酸溶于20 mL偶联缓冲液中。平衡淋洗液（pH 4.0）：CH3COOH 0.58 mL，NaCl 2.92 g，双蒸水定容100 mL，用1 mol/L的无水乙酸钠调节其pH到4.0，4℃保存备用。溶胀酸液（pH 3.0）：41.66 μL的浓盐酸，双蒸水定容到500 mL。底物液（TMB-过氧化氢脲溶液）：底物液A：无水醋酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg，加双蒸水至1 000 mL，调节pH至5.0，4℃保存，使用时恢复至室温。底物液B：100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前15 min混合，14.6 mL A溶液和0.45 mL B溶液。

1.4方法

1.4.1恩诺沙星酶标抗原的制备

称取恩诺沙星半抗原8.9 mg溶于150 μL的无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中使其完全溶解，在搅拌状态下加入3.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和12.4 mg N，N'-二环已基碳二亚胺（DCC），室温避光反应4 h～6 h。溶液有浑浊物产生，离心（4℃，10 000 g，5 min）除去沉淀，在冰浴条件下将上层活化酯溶液缓慢逐滴加入到3 mL溶有10 mg HRP的碳酸氢钠（130 mmol/L，pH 8.1）溶液中，4℃下搅拌反应过夜，然后将反应液吸出装入透析袋，在4℃下用pH 7.4的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，然后将透析液取出，保存备用。

1.4.2封闭胶的制备

1）溶胀：称取1.00 g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到100 mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10 min。

2）淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。

3）封闭：加入10 mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2 h。

4）清洗：首先加入10 mL的偶联缓冲液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸钠缓冲溶液和10 mL的偶联缓冲液分别冲洗。

5）贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS 1∶3（体积比）悬起，约10 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.3抗体胶的制备

1）溶胀：准确称取0.50 g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到50mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10min。

2）淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。

3）偶联抗体：取0.50 mg/mL抗体，用1 mL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2 h。

4）封闭：加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震荡反应2h。

5）清洗：首先加入10 mL的偶联缓冲液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸钠缓冲溶液和10 mL的偶联缓冲液分别冲洗。

6）贮存：待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS 1∶3（体积比）悬起，约5 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.4检测柱的制备

质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合后，取150 μL混合胶加入到1 mL的SPE固相萃取柱中，用注射器活塞将PBS压出。检测层是由恩诺沙星抗体胶与封闭胶以一定的比例混合后，取150 μL加入其中，用注射器活塞将PBS压出。检测柱由下到上分别是质控层和检测层。将聚乙烯垫片加入1 mL的SPE固相萃取柱中，然后加入质控层混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，在质控层上方约3 mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。

1.4.5检测柱检测步骤和检测限

1）加样：将1 mL按一定比例稀释的酶标记物与恩诺沙星标准品或样品溶液混合液，通过进样口通过柱子，控制流速在2 min流完。

2）洗柱：用3 mL PBST由进样口加入冲洗柱子，再用2 mL PBS冲洗去除未与抗体结合的抗原与残留的Tween-20。

3）显色：从底端吸入300 μL底物液，反应30 s后，用注射器活塞注入空气，将底物液完全排出，继续显色3 min后，观察显色情况。

以检测层颜色刚好消失时待测物的浓度定义为检测柱的检测限。

1.4.6实际样品的检测

猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉组织样品和牛奶样品处理方法如下：

组织：称取1 g匀浆好的组织样品于15 mL离心管中，加1.6 mL乙腈，0.4 mL NaOH（0.1mol/L），3 000 r漩涡混匀2 min，离心（15℃，2 500 r/min，10 min），用pH 7.4PBS稀释10倍。然后取1 mL的稀释液与酶标混合后，加入凝胶检测柱进行检测。

牛奶：取1 mL牛奶样品加入离心管中，用pH 7.4 PBS稀释20倍，然后取1 mL的稀释液与酶标混合后，直接加入凝胶检测柱进行检测。

2结果与分析

2.1检测柱检测条件的确定

为了缩短检测时间，使检测结果易于判断，需要对质控层HRP抗体胶的用量、检测层恩诺沙星抗体胶的用量、酶标记物稀释度、抗原抗体结合反应时间和酶催化底物反应时间等检测条件进行优化，从而达到快速可视化检测的目的。

经优化试验，质控层HRP抗体胶与封闭胶用量比为1∶49（体积比），检测层恩诺沙星抗体胶与封闭胶用量比为1∶14（体积比），酶标记物稀释倍数为1∶100 000，抗原抗体结合反应时间为2 min，酶催化底物反应时间为3 min，此条件下的检测层与质控层显色后显现出清晰的蓝色，且质控层和检测层颜色一致，如图1所示，图中上层为检测层，下层为质控层。

2.2检测柱检测限的确定

可视化凝胶检测柱检测恩诺沙星结果如图2所示。

如图2所示，使用检测柱分别检测浓度为0、1、2、5 μg/L的恩诺沙星标准品时，当恩诺沙星浓度为0 μg/L时，检测柱的质控层和检测层颜色一致，而随着恩诺沙星浓度的增加，检测层的颜色逐渐变浅，当恩诺沙星浓度为5 μg/L时，检测柱的检测层颜色完全消失，因此确定该免疫凝胶检测柱的检测限为5 μg/L。

图1　检测柱检测条件优化Fig.1Optimization of the gel test column

图2　可视化凝胶检测柱检测恩诺沙星Fig.2Detection of enrofloxacin with the visual gel test column

2.3方法特异性

使用恩诺沙星凝胶检测柱检测时，当恩诺沙星浓度为5 μg/L时，检测柱的检测层颜色完全消失。对于其他喹诺酮类兽药和其他种类的兽药，当其浓度达到500 μg/L时，检测柱的检测层仍会出现明显的蓝色，方法与其他药物没有交叉反应，说明使用此凝胶检测柱检测恩诺沙星残留具有很好特异性。

2.4实际样品的检测

猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉和牛奶样品分别添加最终浓度为0、20、40、100 μg/kg的恩诺沙星。添加后的样品经过1.4.6所提到的方法处理后直接用于凝胶检测柱进行检测，结果如图3所示。

检测没有添加恩诺沙星的动物源性食品样品的检测柱的质控层和检测层颜色一致，而随着恩诺沙星添加浓度的增加，检测层的颜色逐渐变浅，当恩诺沙星添加浓度为100 μg/kg时，检测柱的检测层颜色完全消失，因此确定该免疫凝胶检测柱检测猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉和牛奶等动物源性食品样品的检测限为100 μg/kg。

图3　可视化凝胶检测柱检测动物源性食品中恩诺沙星Fig.3Detection of enrofloxacin in animal-derived foods with the visual gel test column

3结论

本研究建立了一种检测动物源性食品中兽药恩诺沙星残留的新型可视化免疫凝胶柱方法。该凝胶检测柱方法的检测限为5 μg/L，整个检测过程可以在10 min内完成，针对动物源性食品的恩诺沙星检测限为100 μg/kg。该方法成本低，操作简单，结果判断容易，只需根据检测柱的检测层颜色深浅和颜色有无就可以定性或半定量检测恩诺沙星的含量，适合动物源性食品中恩诺沙星残留的快速筛查。

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Development of A Gel-based Rapid Visual Immunoassay for the Detection of Enrofloxacin

SHENG Wei，WU Xue-ning，HU Gao-shuang，LI Shi-jie，LIU Yue，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A new gel-based visual immunoassay was developed for the rapid screening of enrofloxacin residues in animal-derived foods.The enrofloxacin was conjugated to HRP accordig to the active ester method.Thegelbased test column in an empty SPE cartridge（1 mL）consisted of a test layer containing anti-enrofloxacin antibody coupled gel，and a control layer with anti-HRP antibody coupled gel.Based on the direct competitive immuno-reaction and the horseradish peroxidase enzymatic reaction，the test results could be evaluated visually according as color development.The limit of detection（LOD）of this gel-based immunoassay was 5 μg/L and the whole procedure was completed within 10 min.The LODs of this assay for enrofloxacin in animal-derived foods were 100 μg/kg.The gel-based visual immunoassay allows for accurate，sensitive，specific，rapid，and lowcost detection of enrofloxacin residues in animal-derived foods.

enrofloxacin；geltestcolumn；visualdetection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.027

2015-11-12

“十二五”国家科技计划课题（2012BAD28B05）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（13JCQNJC15300）；国家国际科技合作专项项目（2014DFR30350）

生威（1980—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品安全检测。