水产品中喹诺酮类和磺胺类兽药残留检测方法的建立

金钥，孙延斌，崔进，梅连瑞，赵瑞，闫师杰，4，*，刘祥，*

（1.天津农学院水产学院，天津300384；2.国家加工食品质量监督检验中心，天津300308；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；4.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

水产品中喹诺酮类和磺胺类兽药残留检测方法的建立

金钥1，2，孙延斌1，崔进2，梅连瑞2，赵瑞3，闫师杰3，4，*，刘祥2，*

（1.天津农学院水产学院，天津300384；2.国家加工食品质量监督检验中心，天津300308；3.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；4.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

建立了水产品中24种兽药残留的QuEChERS结合液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）测定的分析方法。样品经1%醋酸乙腈提取离心后，加入到无水硫酸钠的离心管中，上清液旋蒸至近干，甲醇溶解，经C18填料净化，氮吹浓缩，初始流动相定容，0.22 μm滤膜过滤，进行UPLC-MS/MS测定，内标法定量。流动相为水、乙腈（均含有0.1%甲酸），色谱柱为WatersBEHC181.7μm，2.1mm×100mm。在1μg/kg～20 μg/kg范围内，目标兽药的线性相关系数大于0.99，定量下限范围为0.5μg/kg～1μg/kg。目标化合物的回收率为69%～124%，相对标准偏差为1%～19%。

UPLC-MS/MS；QuEChERS；水产品；喹诺酮类；磺胺类

磺胺类药物和喹诺酮类药物作为两种廉价有效的人工合成抗菌药物被广泛大量的应用于我国的高密度集约化养殖中，不当超量的使用及不遵守休药期造成该两种药物在动物体内积蓄残留，会对人们的身体造成潜在的危害［1］。就此，许多国家及国际组织对不同基质（猪、牛、羊、水产等）中的兽药残留制定了最大允许残留限量（MRLs）［2-3］，如日本制定MRLs的兽药和添加剂种类多达231种，欧盟为121种，CAC为57种，美国为87种，加拿大为85种，中国为134种。因此，建立一种灵敏、可靠、同时检测技术十分必要。

超高效液相串联质谱法（UPLC-MS/MS）［4-5］技术无需对样品进行衍生化处理，可同时测定多个目标物，具有高选择性、高灵敏度、高通量的优势，使得该技术在食品安全分析中得到广泛应用。QuEChERS（一种新型前处理技术，快速Quick、简单Easy、价廉Cheap、高效Effective、耐用Rugged、安全Safe的缩写）［6-7］自问世以来被广泛的应用在农药残留检测的样品处理中；由于其相对传统兽药残留处理方法有诸多明显优势，并逐步的应用到兽药的残留分析［8］之中。目前，检测方法已有报道，GABOR BALIZS等使用LC-MS检测肉中的磺胺兽药残留［9］；Hubert Po-on Tang等建立了同时检测4种大环内酯类（红霉素、交沙霉素、北里霉素、泰乐菌素）、6种喹诺酮类（环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氟甲喹、恶喹酸、沙拉沙星）和林可霉素、维及霉素M1、三甲氧苄二氨嘧啶共13种残留物的在线固相萃取液相色谱-串联质谱法［4］以及孙伟红等用HPLC-MS/MS内标法同时测定水产品中18种磺胺类药物残留量［10］，但可以看出，同时检测此两类药物的前处理通常较繁琐，检测成本高，而本文采用QuEChERS结合UPLCMS/MS对水产品中12种喹诺酮类和12种磺胺类兽药同时进行测定，通过优化样品前处理条件及色谱、质谱条件，建立了一次同时提取正离子模式测定喹诺酮类和磺胺类种药物残留的新方法。

1材料与方法

1.1材料与仪器

超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪（美国AB公司，AB Triple Quad 6500；美国安捷伦公司，Agilent 1290）；天平（Mettler-Toledo公司，ML204/02）；旋转蒸发仪（德国IKA公司，RV10）；离心机（美国Thermo公司，PICOZ1）；氮吹浓缩仪（美国Organomation公司，OA-SYS）；超纯水（屈臣氏蒸馏水）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Honeywell公司）；甲酸（ACS纯，美国Sigma公司）；C18填料（天津博纳-艾杰尔公司）；醋酸为优级纯；无水硫酸钠为分析纯。标准物质：吡哌酸（CAS：51940-44-4）、西诺沙星（CAS：28657-80-9）、萘啶酸（CAS：389-08-2）、诺氟沙星（CAS：70458-96-7）、氧氟沙星（CAS：82419-36-1）、依诺沙星（CAS：74011-58-8）、单诺沙星（CAS：119478-55-6）、环丙沙星（CAS：93107-08-5）、洛美沙星（CAS：98079-52-8）、氟甲喹（CAS：42835-25-6）、恩诺沙星（CAS：93106-60-6）、沙拉沙星（CAS：91296-87-6）、磺胺嘧啶（CAS：68-35-9）、磺胺噻唑（CAS：72-14-0）、磺胺甲基嘧啶（CAS：127-79-7）、磺胺二甲嘧啶（CAS：57-68-1）、磺胺甲氧哒嗪（CAS：80-35-3）、磺胺对甲氧嘧啶钠（CAS：18179-67-4）、磺胺间甲氧嘧啶钠（CAS：1037-50-9）、磺胺氯哒嗪（CAS：80-32-0）、磺胺多辛（CAS：2447-57-6）、磺胺甲恶唑（CAS：723-46-6）、磺胺异恶唑（CAS：127-69-5）、磺胺地索辛（CAS：122-11-2）均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司；D8环丙沙星、D3磺胺邻二甲氧嘧啶、D6磺胺间甲氧嘧啶均购于德国Witega公司；D5恩诺沙星购于加拿大TRC公司；D5诺氟沙星购于加拿大C/D/N公司。各标准品纯度均99.0%以上。

标准溶液及内标溶液的配制：以乙腈为溶剂，分别配制质量浓度范围在0.2 mg/mL～1 mg/mL的标准储备溶液，置棕色容量瓶避光4℃或-18℃保存，保存期为3个月；中间标准工作液配制成10 μg/mL的混合标准中间液，保存期为1个月；用时根据需要，用初始流动相对中间液进行稀释，稀释成适当浓度作为标准工作液，保存期为1周。

1.2样品前处理

取代表性背脊部分鱼肉进行破碎，其余贝类、虾类取可食用部分进行破碎，置于-18℃冰箱保存。称取2 g（精确到0.01 g）破碎好的鱼肉样品于50 mL离心管内，加入10 ng的内标溶液，加入10 mL 1%醋酸乙腈，匀浆混匀；5 000 r/min，离心5 min，上清液置于另一离心管中，重复提取2次，合并提取液；提取液加入装有5 g无水硫酸钠的离心管中，离心后上清液转移至圆底烧瓶中，在40℃、60 r/min减压的条件下旋转蒸发至近干，加入5mL甲醇，转移至装有C18填料的离心管中，用8 mL甲醇分数次洗涤圆底烧瓶，同样转移至装有C18填料的离心管中，收集上清液，氮吹至近干；用2 mL流动相复溶，经0.22 μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS上机分析检测。

1.3色谱-质谱条件

1.3.1色谱条件

色谱柱为Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm×100 mm；流动相A为水，B为乙腈（均含有0.1%甲酸），梯度洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序Table 1Program of gradient elution

分析时间为30 min，后运行时间为5 min；流速为300 μL/min；柱温为30℃；进样量为5 μL。

1.3.2质谱条件

正离子模式扫描（ESI+）；多反应监测采集方式（MRM）；雾化气压力（GS1）：413.7 kPa；辅助气压力（GS2）：413.7 kPa；气帘气压力（CUR）：206.8 kPa；离子源温度：550℃；电喷雾电压（IS）：5 500 V；各化合物的碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）等质谱参数见表2。

表2　24种化合物的质谱采集参数Table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

续表2 24种化合物的质谱采集参数Continue table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

2结果与讨论

2.1样品前处理方法的优化

2.1.1提取剂的选择

对于水产品中兽药多残留的同时测定，提取方式是关键，常用的提取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。经研究发现，以乙酸乙酯、甲醇溶液提取时，油脂等杂质不易去除，而且对蛋白的沉积效果也一般。乙腈可避免从组织中提取出过多的脂肪，同时具有很好的蛋白沉积效果，因此，确定采用乙腈作为提取溶剂［11］。之后又对提取剂的酸度进行优化，考虑了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈。试验数据显示，用1%醋酸乙腈提取时，各药物回收率大多数均在80%～120%之间，纯乙腈的回收率只有60%在范围内，5%醋酸乙腈提取的药物时，干扰物较多，回收率不稳定。因此，本方法选择1%醋酸乙腈作为提取剂。

2.1.2QuEChERS方法盐析剂和吸附剂的选择

盐析剂在样品提取时起到了重要的作用，可以防止样品中的水分及水溶性杂质进入提取液，达到脱水和盐析作用，还可促使蛋白质变性分散，防止样品形成块状影响提取效率［12-13］。分别比较了无水硫酸钠、无水硫酸镁，无水硫酸镁和无水硫酸钠混合盐3种盐析剂。无水硫酸钠的杂峰少而且响应最低，确定以无水硫酸钠为盐析剂。

吸附剂比较了C18、PSA及C18与PSA的混合物对水产品基质的净化效果及回收率。从得出结果显示，C18的净化效果和回收率较好。其他2种吸附剂净化的样品在过滤膜后均呈浑浊状态。分析原因为C18主要吸附的杂质是脂类化合物，而PSA主要吸附脂肪酸、有机酸和色素等，而鱼肉样品的主要杂质为脂类，正适合用C18去除杂质。因此，选取C18作为试验的净化吸附剂。

2.2质谱与色谱条件的优化

2.2.1质谱条件的优化

质谱条件中的去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）的大小影响离子的丰度，与方法的灵敏度密切相关［14］。本文用乙腈配制的大约浓度为25 ng/mL的标准品，以不连接液相，直接针泵进样的方式对24种组分以及5种内标物的去簇电压及碰撞能量进行了优化。

2.2.2色谱条件的优化

比较了Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse Plus C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）色谱柱，结果显示，Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）对24种化合物的分离情况及响应值均高于其他，峰型尖锐且无漂移现象，对实际样品的检测适用性更好，最终选择Waters BEH C18色谱柱。

在液质检测中，甲醇、乙腈常作为流动相，考虑乙腈作为流动相时，峰形较尖锐，较好定量，选择乙腈作为流动相［15］；甲酸有增强离子化的作用，提高方法的灵敏度，故本试验在水相和有机相中分别加入0.05、0.1、0.2%的甲酸进行试验，从回收率方面看，当添加0.1%甲酸时，回收率最高。根据以上优化所得到的条件，24种兽药及5种内标分离谱图见图1。

图1　24种组分及5种内标组分混合标准溶液的MRM色谱图Fig.1MRM chromatogram of 24 analytes and 5 internal standards mixed standard solution

2.3方法学验证

标准曲线与检出限采用鱼肉（天津养殖的鲤鱼、鲢鱼、石斑鱼，以及南美白对虾、毛蛤、扇贝）阴性样品进行5点内标标准工作曲线的绘制［15-16］，在选定的色谱和质谱条件下进行测定，以10倍信噪比计算24种兽药的检定量下限（LOQ）为0.5 μg/kg或1.0 μg/kg，各种药物均低于我国规定的MRLs，结果见表3。结果显示，24种兽药在质量浓度为1 ng/mL～20 ng/mL范围内的线性关系良好，相关系数在0.99以上。

表3　24种兽药的定量下限、回归方程、线性系数、回收率与相对标准偏差（n=5）Table 3Limits of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 24 veterinary drugs（n=5）

3结论

本研究以鲤鱼、鲢鱼、石斑鱼等作为样本，采用1%醋酸乙腈提取，以QuEChERS方法为前处理方法，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）为流动相，建立了UPLCMS/MS同时测定水产品中24种兽药残留的分析方法。该方法目标兽药的线性相关系数大于0.99，定量下限范围为0.5 μg/kg～1 μg/kg，回收率为69%～124%，相对标准偏差为1%～19%。本方法检测周期短、前处理技术简单，无需特殊实验装置，实验成本低，为大批量水产品兽药残留检测提供了简便可靠的筛查方法。

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Establishment of Detection Method of Quinolones and Sulfonamides in Aquatic Products

JIN Yue1，2，SUN Yan-bin1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，ZHAO Rui3，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1.College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

A method was developed for the simultaneous determination of 24 veterinary residues by QuEChERS and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The sample was extracted with 1% acetonitrile acetic acid and centrifuged with centrifugal machine.The supernatant liquid was directly passed with anhydrous sodium sulfate.Then，the extract was evaporated under rotary evaporator，dissolved in methanol，passed with C18，the extract was evaporated under nitrogen stream and redissolved with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）.The HPLC separation was performed on Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm× 100 mm by gradient elution with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）as mobile phase.Under the optimal conditions，the veterinaries were larger than 0.99 in the linear range of 1 μg/kg-20 μg/kg，the limits of quantitation ranged from 0.5 μg/kg to 1 μg/kg.The recoveries of 24 veterinary at three spiked levels were between 69%and 124%，their relative standard deviations were in the range of 1%-19%.

UPLC-MS/MS；QuEChERS；aquatic products；quinolones；sulfonamides

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.029

2015-11-18

国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ510391）

金钥（1990—），女（汉），在读硕士研究生，主要从事动物性食品安全与营养方面的研究。

闫师杰（1971—），男（汉），教授，博士，主要从事食品质量与安全方面的研究与教学。刘祥（1976—），男（汉），正高级工程师，博士，主要从事食品安全检测与分析。