应用微波提取法与RT-PCR技术进行肉制品鉴别

陈筱婷

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510640；2.福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建福州350000）

应用微波提取法与RT-PCR技术进行肉制品鉴别

陈筱婷1，2

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510640；2.福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建福州350000）

为更好地利用实时荧光PCR技术鉴别肉制品的真实属性，创新性地采用微波提取法对样品均质液进行DNA提取，并且根据不同物种动物的基因序列设计特异性的引物与探针，根据实时荧光PCR扩增结果确定肉制品所含物种成分。在30份牛肉制品中，检测出有7份样品含有猪、鸡或鸭源性成分，检出率约为23.3%；在20份羊肉制品中，检测出有5份样品含有猪、鸡或鸭源性成分，检出率为25.0%。微波提取DNA的方法优化了DNA提取流程，使不同类型肉制品中提取DNA可在短时间内完成，极大地提高了检测效率。开发的样品前处理方法、DNA提取方法具有灵敏度高、特异性强等优点，可广泛应用于肉制品及其相关产品真实属性的鉴别，具有良好的社会效益与经济效益。

肉制品；种类鉴别；微波提取法；实时荧光PCR

肉制品在国际食品市场中占有举足轻重的地位，肉制品种类鉴别在食品贸易中具有极其关键的作用。食品的全球贸易需要考虑不同国家、不同文化以及不同宗教的饮食习惯，并遵循相应规则。由于猪肉在伊斯兰教、犹太教以及我国回族居民中是被禁止食用的，因此人们对食品中是否含有猪肉成分的关注度较高。另一方面由于牛肉、羊肉的价格较其它肉类高，在肉制品加工行业存在以低价肉冒充高价肉，以次充好的现象。原料肉经过各项加工工序通常已经失去原有形态，已不能通过传统的经验判断、感官鉴别或是经典的生化分析方法来对肉类物种进行鉴定。目前应用于肉制品种类鉴别的方法较多，主要有蛋白分析法、核酸分析法、脂肪酸分析法等［1-8］，具体的分析方法包括PCR、HPLC、FTIR法等［9-14］。

PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一种技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于食品来源种类的检测鉴别中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分等［15-16］，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等［17-19］。结合先进的实时荧光定量PCR技术，以DNA为基础的检测技术在食品原材料以及加工食品种属鉴定中获得了迅猛长足的发展。由于PCR技术具有准确性高、特异性强、灵敏度高等优点，使得PCR技术在物种鉴定等领域获得广泛的应用，可快速准确地为食品掺假的监管提供有力的证据。

对于常规样品DNA的提取与纯化，目前已有较多商业化试剂盒应用于科研以及检测行业中。然而针对大规模的样品筛查检测，使用试剂盒进行提取具有成本高，提取时间长等诸多不足。为了降低研究成本以及提高实验速度，本研究开发了一种快速检测肉制品真实属性的方法。该方法基于各物种不同的线粒体等基因序列设计合成专一性的扩增引物与探针，创新性地采用微波法提取样品中的核酸，根据PCR扩增结果判断肉制品种属成分。

本研究对建立的肉制品提取方法以及荧光PCR方法进行了灵敏度测试，在多种不同类型的样品中验证方法与引物的有效性与可靠性。研究方法不仅可应用于肉制品成分的检测，也可应用于其他产品中相关成分的检测。需要特别指出的是，不同种类的样品需要在本方法基础上再进行合理的优化设计，最终建立一个快速稳定可靠的检测体系。

1材料与方法

1.1试验材料

牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉标准品均购于中国检验检疫科学研究院测试评价中心；牛肉制品、羊肉制品等测试样品购自超市。

1.2试验试剂

Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、蛋白酶K购自TAKARA公司（大连宝生物工程有限公司）；裂解缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，10%SDS）；去离子水（Promega）。

1.3仪器设备

7500荧光定量PCR仪：美国ABI公司；SmartSpec plus核酸蛋白分析仪：美国Bio-Rad公司；微量可调移液器：德国Eppendorf公司；微波炉：中国美的集团股份有限公司；Minispin台式离心机：德国Eppendorf公司；MS 3漩涡混合仪：德国IKA公司；DB-3D热块加热器：英国TECHNE公司；Savant DNA 120 SpeedVac DNA浓缩仪：美国Thermofisher公司；Hfsafe1200生物安全柜：上海力申公司。

1.4引物与探针

具体引物与探针信息见表1，引物与探针委托上海生物工程有限公司合成。

表1　引物和探针DNA序列Table 1DNA sequences of the primers and probes

1.5样品前处理

以中国检验检疫科学研究院测试评价中心购买的肉制品标准品作为阳性对照，对市场中购买的肉制品进行主动性监测研究。肉制品样品均有独立的包装，在取样时为了避免交叉污染，于样品前处理室分别独立取样，于粉碎机中粉碎，粉碎杯在取完每个样品后更换，粉碎杯在使用后立即清洗、消毒并灭菌。

样品研磨粉碎均匀后，取2 g样品，加入10 mL裂解缓冲液，将样品与裂解液混合溶液涡旋震荡5 min，获得均质的溶液，置于56℃放置45 min，每隔15分钟涡旋振荡3 min。

1.6微波法提取样品DNA

涡旋振荡后，放置3 min让样品颗粒沉降，吸取上层清液转移至2.0 mL离心管中。为了避免微波加热过程中离心管的变形或破裂，离心管应均匀对称放置于微波炉载物台上，并在微波室内放一杯蒸馏水，防止样品过热。放置好样品后，根据样品数量微波加热1 min～3 min，经微波处理后的管内液体温度约为75℃～85℃。微波提取后，13 000 r/min离心5 min。离心后，转移裂解上清液至一新的离心管中，上清液即为DNA模板溶液。用核酸蛋白质测定仪测定其浓度，根据测定值将样品DNA浓度稀释至200ng/μL，置于冰箱中保存。1.7荧光PCR反应初始体系及荧光PCR仪循环程序

荧光PCR反应初始体系见表2，荧光PCR仪循环程序见表3。

表2　荧光PCR反应初始体系Table 2Original fluorescent PCR system

表3　荧光PCR仪循环程序Table 3The thermal program for fluorescent PCR

2结果与分析

2.1荧光PCR引物与探针的特异性验证

分别使用牛、羊、猪、鸡、鸭5种物种的标准品DNA为模板，以表2中的反应体系和表3的循环程序对引物以及探针进行特异性验证，具体结果见图1及表4。

由图1及表4可知，本研究合成的6对引物及其探针均有良好的特异性与灵敏度，只对目标DNA模板进行扩增，Ct值均小于30。非目标模板DNA及阴性对照在40个循环内均未出现扩增曲线。

2.2方法检出限测试

为了测试猪源性成分检测方法的灵敏度与检出限，我们将猪肉粉以10%，5%，1%，0.5%，0.3%，0.1%，0.01%（质量比）的比例掺入牛肉粉中。按照本研究方法提取DNA后通过PCR试验，结果见图2。

图中横坐标Cycle代表实时荧光PCR所经历的循环数；△Rn代表标准指示信号值减去基线信号值。

由图2可知，采用本研究方法可以检测出低至含有0.1%浓度猪肉成分的混合样品。即使在牛肉粉中只掺入0.1%猪肉粉，我们依然可以检测出猪源性成分。其他动物源性成分的灵敏性测试同猪源性成分测试方法，具体的检出限见表5。

图1　荧光引物及其探针的特异性试验Fig.1The specificity results of primers and probes

表4　荧光PCR的特异性结果Table 4The specificity of fluorescent PCR（The number in table is Ct value，U.D.means undetermined）

2.3市售牛羊肉制品检测结果

为了评价方法的可靠性与适用性以及了解市售牛肉制品、羊肉制品情况，我们从市场中购买了30份牛肉制品与20份羊肉制品。采用本研究方法进行核酸提取与PCR分析，除检测出牛源性成分外，我们从30份牛肉制品中检测出2份牛肉制品含有猪源性成分，2份牛肉制品中含有鸡源性成分，3份牛肉制品含有鸭源性成分。除检测出羊源性成分外，我们从20份羊肉制品中检测出1份羊肉制品含有猪源性成分，2份羊肉制品含有鸡源性成分，2份羊肉制品中含有鸭源性成分。检测结果见图3。

图2　猪源性成分荧光PCR的检出限Fig.2Detection limit of porcine derived components

表5　动物源性成分荧光PCR的检出限Table 5The detection limit of fluorescent PCR

3讨论

图3　市售样品检测结果Fig.3The test results of market samples

近年来随着“假牛肉”、“假羊肉”等事件的曝光，肉制品掺假已成为亟待解决的食品安全监管问题。实时荧光PCR技术具有实时监测、特异性高、灵敏度强等优点，已成为对动物、植物源性成分进行检测的重要技术方法。但是由于食品如肉制品基质的复杂性，使得PCR技术在食品掺假鉴别中的应用也受到了一定的限制。在肉制品加工处理过程中，DNA分子存在不同程度的降解，加工辅料如添加剂、防腐剂等的引入也会对PCR反应带来一定的干扰，且肉制品脂质蛋白质含量较高引入很多杂质。上述种种原因都可能会导致最终结果的偏差。因此，急需开发更为科学有效的针对肉制品DNA的提取方法。

本研究创新性地采用微波法提取肉制品DNA，在高温高能量的作用下，在pH 6.0～9.0裂解体系的环境中，我们可以获得较高产量的DNA。与常规的DNA提取方法相比较，微波提取DNA法由于微波辐射的能量很高，可以将样品的沸点较通常水平提高25℃左右。在这样的情况下，更高的裂解沸点可以获得更快的DNA提取效率。微波处理后，通过高速离心，可以尽量减少添加剂等的干扰，获得质量较高的样品核酸，方法简便快捷经济，特别适合于大批量样品的DNA提取。另外根据常见肉制品种类进行设计相应物种的特异性引物和探针，通过标准品DNA的实时荧光PCR反应证明了引物及探针的特异性。在优化的PCR反应体系的基础上，对方法的灵敏度进行试验，得到该方法对牛、羊、猪、鸡与鸭源性成分的检测灵敏度在0.1%～0.3%之间。

通过对市场中肉制品种属成分进行检测分析，我们发现市场中牛肉制品以及羊肉制品存在不同程度的掺假行为。在30份牛肉制品中有7份样品检测出猪、鸡或鸭源性成分，检出率约为23.3%；在20份羊肉制品中有5份样品检测出猪、鸡或鸭源性成分，检出率为25.0%。从上述数据可以看出，市场中“假牛肉”、“假羊肉”依然存在，严重地扰乱了市场秩序，同时也极大损害了消费者的权益。

本研究开发的快速检测方法可以为肉制品样品种属成分测试节约大量的时间，同时本方法采用的微波加热方法提取样品DNA具有一定的创新性与广泛的适用性，特别适合复杂基质样品如食品等样品DNA的提取，方法可以推广应用于不同类型的样品中，为样品DNA的提取以及食品种属鉴别开拓新的思路。通过进一步优化试剂组合，本方法可以开发试剂盒或用于商业推广，是食品监管部门进行食品掺假监管的有力工具，具有重大的价值与意义。

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Detection of Meat Species in Meat Products by Microwave Irradiation and Real-time PCR

CHEN Xiao-ting1，2
（1.College of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Fuzhou），Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350000，Fujian，China）

A unique DNA isolation protocol based on microwave irradiation and density centrifugation for the simultaneous detection of bovine，caprine，ovine，porcine，chicken and duck species in meat products by PCR using newly developed primers was described.The method had been optimized using the primers designed from mitochondrial DNA（mtDNA）sequence and tested in 50 samples.To evaluate the method，30 beef products and 20 mutton products were analyzed by microwave irradiation and RT-PCR technique.Porcine，chicken and duck content was detected in beef products and mutton products.The design of this protocol makes it possible to process many samples in a short time.The new set of primers and the method involved showed high sensitivity in detecting beef，mutton，porcine，chicken and duck content in meat products.The present sample preparation method has the potential to be applied to other meat detection systems as well.

meat products；species detection；microwave irradiation；real-time PCR

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.041

2016-06-25

陈筱婷（1986—），女（汉），助理工程师，本科，研究方向：食品安全与检测。