酶辅助超声提取松茸多糖及其抗运动疲劳作用

关长亮，张宇

（1.河海大学体育系，江苏南京210098；2.湖南师范大学体育学院，湖南长沙410012）

酶辅助超声提取松茸多糖及其抗运动疲劳作用

关长亮1，张宇2

（1.河海大学体育系，江苏南京210098；2.湖南师范大学体育学院，湖南长沙410012）

采用酶辅助超声波法提取松茸中的多糖，并利用单因素和正交试验对提取工艺进行优化，在此基础上探讨松茸多糖的抗运动疲劳作用。结果表明，酶辅助超声波提法提取松茸多糖的最佳提取工艺为：超声时间25 min，超声功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%。在此条件下松茸多糖的提取率可达13.97%。小鼠负重游泳实验和抗疲劳生化指标结果表明松茸多糖具有良好的抗运动疲劳能力。

松茸；多糖；酶辅助超声法；正交试验；抗运动疲劳

松茸（Tricholoma matsutake），学名松口蘑，味道鲜美、肉质嫩滑，是一种深受广大消费者喜爱的纯天然食药用菌［1-2］。松茸以营养丰富著称，尤其松茸多糖具有抗氧化、提高机体免疫力、抗肿瘤、降血脂、抗病毒等功效［3-5］。因此，松茸多糖（polysaccharide from Tricholoma matsutake，PTM）的提取历来备受关注。目前，多糖的提取方法有直接水提法、乙醇沉淀法、微波提取法和超声提取法等［6-9］。然而，上述方法都需要在较高的温度中进行，随着生物酶技术的发展，将酶技术和超声技术相结合可以实现在较低温度下提取植物中的多糖成分，从而节约提取成本［10］。此外，研究发现植物多糖的抗氧化能力和抗运动疲劳之间存在着一定的内在联系［11-13］，因此松茸多糖是否也具有抗运动疲劳能力需要进行深入的研究。本研究以松茸为研究对象，利用酶辅助超声波法对松茸中的多糖进行提取，并利用正交试验探究提取的最优参数，达到提高松茸多糖的提取率和节约成本的目的。最后通过小鼠负重游泳实验和抗疲劳生化指标分析揭示松茸多糖的抗运动疲劳活性，以期拓展松茸多糖的应用范围。

1材料与方法

1.1材料与试剂

松茸：选择完好无损，新鲜无无腐败变质的松茸，购自黑龙江省双鸭山市八五三农场。

葡萄糖标准品：上海楚定分析仪器有限公司；纤维素酶，和氏璧生物技术有限公司；苯酚溶液：东莞市东江化学试剂有限公司；95%乙醇：常熟杨园化工有限公司；浓硫酸：广州市上泰化工有限公司。上述试剂均为分析纯。尿素氮（BUN）检测试剂盒，乳酸测定试剂盒，糖原测试盒，上述试剂盒均购自南京建成生物制品研究所。

1.2仪器与设备

JA1003N电子精密天平：上海精科天美贸易有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机、RT-25气流式粉碎机：上海比朗仪器制造有限公司；TY10KQ-400KDB台式高功率数控超声波清洗器：北京中仪友信科技有限公司；UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；小鼠恒温游泳箱：上海艾研生物科技有限公司。

2方法

2.1松茸多糖的制备及含量测定

根据蔡啸镝等［14］的报道以葡萄糖标准液浓度（mg/ L）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。利用真空冷冻干燥设备对松茸进行干燥，之后进行粉碎。精确称取10.0 g的松茸粉末，根据黄丹丹等［15］的方法对松茸中多糖的含量进行提取和测定，松茸多糖提取率计算公式如下：

式中：C为对应多糖的浓度，（mg/L）；V为滤液体积，mL；W为提取率，%；m为松茸提取样本质量。

2.2单因素试验

由于本实验选取在纤维素酶最适pH（pH 6）和最适温度（45℃）下进行［16］，因此选取优化的参数为超声时间、超声功率、料液比和酶的添加量。

超声时间对松茸多糖提取率的影响：在超声功率为220 W，料液比为1∶30（g/mL），酶添加量为2.6%的条件下，选择超声时间分别为10、15、20、25、30 min，分析超声时间对松茸多糖提取率的影响。

超声功率对松茸多糖提取率的影响：在超声时间为25 min，料液比为1∶30（g/mL），酶添加量为2.6%的条件下，选择超声功率分别为180、200、220、240 W和260 W，分析超声功率对松茸多糖提取率的影响。

料液比对松茸多糖提取率的影响：在超声时间为25 min，超声功率为220 W，酶添加量为2.6%的条件下，选择料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分析料液比对松茸多糖提取率的影响。

酶添加量对松茸多糖提取率的影响：在超声时间为25 min，超声功率为220 W，料液比为1∶30（g/mL）的条件下，选择酶添加量分别为1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%，分析酶添加量对松茸多糖提取率的影响。

2.3正交试验设计

为了进一步的酶辅助超声波法提取松茸多糖的工艺，在单因素试验的基础上设计正交试验。选用超声时间、超声功率、料液比和酶添加量4个因素进行优化组合，因素与水平表见表1。

表1　正交试验因素与水平Table 1Factors and levels of orthogonal experiment

2.4松茸多糖抗运动疲劳作用研究

2.4.1动物分组及给药

选取40只雄性小鼠，年龄均为7周，随机分为4组，对照组（A）为空白对照组，灌胃生理盐水；低、中高剂量组分别灌胃不同剂量的松茸多糖［5、10、15 g/（kg·d）］，并分别标号为B、C和D。上述4组小鼠均灌胃28 d，期间小鼠自由饮水和进食。

2.4.2松茸多糖对小鼠负重游泳力竭时间的影响

小鼠末次灌胃30 min后，进行负重游泳实验，负重量为体重的4%，将4组实验小鼠放于水温为25℃，水深为30 cm的游泳箱进行负重游泳实验，记录4只小鼠首次下沉和力竭时间。

2.4.3松茸多糖对抗疲劳生化指标的影响

小鼠负重游泳实验结束后休息1 d，随后进行无负重游泳30 min，利用试剂盒法对4组小鼠进行血清尿素氮（BUN）、血清乳酸（LD）和肝糖原（LG）进行测定。

2.5数据分析

实验结果以平均数±标准偏差表示，并利用SPSS20.0软件对实验数据进行分析，当P＜0.05时可视为具有统计学意义，差异显著。

3结果与分析

3.1单因素试验

3.1.1超声时间对松茸多糖提取率的影响

在超声时间为10、15、20、25、30 min下分析超声时间对松茸多糖提取率的影响，结果如图1。

图1　超声时间对松茸多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of PTM

松茸多糖的提取率随着超声时间的升高而增加，当超声时间大于25℃时，松茸多糖的提取率趋于恒定，因此松茸多糖提取的最佳超声时间为25 min。

3.1.2超声功率对松茸多糖提取率的影响

在超声功率分别为180、200、220、240、260 W的水平下分析超声功率对松茸多糖提取率的影响，结果如图2所示。

图2　超声功率对松茸多糖提取率的影响Fig.2Effect of ultrasonic power on the extraction rate of PTM

在180 W～240W范围内，松茸多糖的提取率也随之增加，当超声功率大于240 W时，松茸多糖的提取率随之下降，这可能是因为较大功率的超声会破坏多糖的结构，因此松茸多糖提取的最佳超声功率为240 W。

3.1.3料液比对松茸多糖提取率的影响

在料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的条件下分析料液比对松茸多糖提取率的影响，结果如图3所示。

图3　料液比对松茸多糖提取率的影响Fig.3Effect of liquid material ratio on the extraction rate of PTM

由图3所示，松茸多糖的提取率随着料液比的增加而增加，当酶添加量大于1∶40（g/mL）时，松茸多糖的提取率趋于恒定，因此松茸多糖提取率的最佳料液比为1∶40（g/mL）。

3.1.4酶添加量对松茸多糖提取率的影响

在酶添加量分别为1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%的条件下分析酶添加量对松茸多糖提取率的影响，结果如图4所示。

图4　酶添加量对松茸多糖提取率的影响Fig.4Effect of enzyme concentration on the extraction rate of PTM

由图4可知，松茸多糖的提取率随着酶添加量的增加而增加，当酶添加量大于2.6%时，松茸多糖的提取率趋于恒定，因此松茸多糖提取率的最佳酶添加量为2.6%。

3.2正交试验

为了得到酶辅助超声波法提取松茸多糖的最佳参数组合，在单因素试验的基础上进行正交试验，并进行方差分析，结果如表2、表3所示。

表2　正交试验结果Table 2Results of orthogonal experiment

表3　方差分析Table 3Variance analysis

由表2可知，4个因素对松茸多糖提取率的影响顺序为：超声功率（B）＞酶添加量（D）＞超声时间（A）＞料液比（C）；超声波乙醇浸提法提取何首乌中多糖的最佳因素水平组合为A2B2C2D3，即超声时间25 min，超声功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%。由表3方差分析可知，4个因素都对松茸多糖提取率有极显著的影响（P＜0.01）。按照上述最优方案进行了3次平行实验，松茸中多糖的提取率分别为14.01%、13.91%、13.98%，3次实验的平均值为13.97%，其结果高于正交试验各组提取率。

3.3松茸多糖抗运动疲劳的研究

3.3.1松茸多糖对小鼠负重游泳力竭时间的影响

利用小鼠负重游泳实验分析松茸多糖的抗疲劳作用，结果如图5所示。

图5　松茸多糖对小鼠游泳耐力的影响Fig.5Effects on swimming endurance of mices of PTM

与空白对照组（A组）相比，灌胃不同剂量的松茸多糖［低（B组）、中（C组）和高（D组）剂量组］均能够显著的增加小鼠首次下沉和负重游泳力竭时间（P＜0.05），并随着给药量的增加小鼠负重游泳的耐力被显著地提高（P＜0.05），这说明了松茸多糖具有抗运动疲劳的作用。

3.3.2松茸多糖对抗疲劳生化指标的影响

利用试剂盒法对4组不同处理小鼠的血清尿素氮、血乳酸和肝糖原进行测定，结果如表4所示。

与空白对照组相比，低剂量、中剂量和高剂量的松茸多糖均能显著的降低小鼠血清尿素氮和血乳酸的含量P＜0.05）。而与空白对照组相比，B、C和D剂量组的小鼠的肝糖原含量则显著的提高（P＜0.05）。

表4　松茸多糖对小鼠跑运动后血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量的影响Table 4Effects on serum urea nitrogen，blood lactic acid and the content of hepatic glycogen of mices after exercising of PTM

4结论

本研究优化了酶辅助超声波法提取松茸多糖的提取工艺，结果表明，松茸多糖提取率的影响顺序为：超声功率＞酶添加量＞超声时间＞料液比，最佳工艺参数为：超声时间25 min，超声功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%，此条件下松茸多糖的提取率为13.97%，小鼠负重游泳实验和抗运动疲劳生化指标分析表明松茸多糖具有良好的抗运动疲劳能力。

［1］徐博文.松口蘑菌株紫外诱变育种、培养条件优化及多糖抗氧化活性研究［D］.合肥：合肥工业大学，2014

［2］王悦，薛伟.不同温度和湿度对松茸保鲜效果的影响［J］.食品工业科技，2012，33（8）：366-368

［3］葛红霞.姬松茸及其多糖的研究进展［J］.畜牧兽医科技信息，2011（11）：4-5

［4］霍俊凤，汉丽梅，马吉飞.姬松茸水溶性多糖对镉中毒小鼠组织器官损伤的保护作用研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2008（7）：85-87

［5］彭勇胜.姬松茸多糖的制备及其抗氧化、保肝作用研究［D］.武汉：华中农业大学，2011

［6］沈爱英，孙震，刘平，等.姬松茸多糖的分离纯化及其对白血病细胞的抑制作用［J］.无锡轻工大学学报：食品与生物技术，2001，20（4）：380-383

［7］贾薇，郭倩，周昌艳，等.姬松茸多糖提取方法初探［J］.食用菌学报，2001，8（1）：43-45

［8］唐小俊，张名位，池建伟，等.姬松茸多糖的微波辅助提取与含量测定［J］.中国食品学报，2006，6（1）：267-272

［9］张娅，李宝才，项朋志，等.松茸多糖超声提取物抗氧化活性研究［J］.化学与生物工程，2011（9）：75-77

［10］周连文，张存兰，刘新华.酶辅助超声波提取何首乌多糖及其抗氧化性研究［J］.食品科技，2008，33（1）：170-173

［11］王凤舞，沈心荷，任嘉玮，等.大枣多糖对香菇多糖抗疲劳抗氧化的增效作用的研究［J］.食品科技，2014（9）：210-215

［12］刘祝祥，尹红，肖琳莉，等.猕猴桃根多糖抗疲劳、抗氧化与单糖组分鉴定［J］.食品科学，2013，34（13）：239-242

［13］李明.黄精多糖对运动疲劳大鼠抗氧化及神经递质的影响［J］.食品科技，2014（9）：227-230

［14］蔡啸镝，刘跃峰.恰玛古多糖的纯化及对运动小鼠抗疲劳活性研究［J］.食品工业，2015（8）：59-62

［15］黄丹丹，朱秋劲，沈奇，等.酶辅助超声提取紫苏迷迭香酸工艺优化及其抗氧化活性研究［J］.中国酿造，2016，35（3）：89-93

［16］郭鸿.水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆和鉴定［D］.南宁：广西大学，2007

Enzyme-assisted Ultrasonic Extraction Technology and Anti-exercise-fatigue Activity of Polysaccharide from Tricholoma matsutake

GUAN Chang-liang1，ZHANG Yu2
（1.Department of Physical Education，Hehai University，Nanjing 210098，Jiangsu，China；2.Institute of Physical Education，Hunan Normal University，Changsha 410012，Hunan，China）

The enzyme-assisted ultrasonic extraction process of polysaccharide from Tricholoma matsutake（PTM）was optimized using the the single factor experiment and orthogonal experiment.On this basis，the antiexercise-fatigue activity of PTM was discussed.The results showed that the optimum extraction condition of PPMT using enzyme-assisted ultrasonic extraction method was：ultrasonic extraction time 25 min，ultrasonic power 240 W，liquid material ratio 1∶40（g/mL），and enzyme concentration 2.9%.Under the optimum conditions，the extraction rate of PTM was 13.97%.The results of the weight-loaded swimming test and biochemical indicators related to anti-exercise-fatigue activity showed that PTM had a good resistance to movement fatigue.

Tricholoma matsutake；polysaccharide；enzyme-assisted ultrasonic extraction；orthogonal experiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.046

2016-07-19

关长亮（1981—），男（满），讲师，硕士，研究方向：体育教育与训练。