在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中的苯并［a］芘

刘春波 申钦鹏 张凤梅 张安丰 何沛 司晓喜 刘志华 杨光宇缪明明

（云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明 650231）

在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中的苯并［a］芘

刘春波 申钦鹏 张凤梅 张安丰 何沛 司晓喜 刘志华 杨光宇*缪明明

（云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明 650231）

建立了在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中的苯并［a］芘方法。采用剑桥滤片捕集烟气粒相物，环己烷萃取，以D12-苯并［a］芘为内标，然后用在线液相-气相二维色谱测定:样品直接进样进入液相色谱，经微型硅胶柱分离，含苯并［a］芘的部位切割进入气相色谱，排干溶剂后启动气相色谱升温，经毛细管柱进行分离，用质谱检测。本方法将烟气苯并［a］芘测定中的硅胶柱层析和气相色谱-质谱分析在线连接起来，可不经样品前处理净化直接进样分析；而且每次进样可达40 μL，与常规气相色谱-质谱分析最大进样2.0 μL相比，分析灵敏度提高了20倍。方法线性范围达0.08～50 ng/L，相关系数为r2=0.999，回收率为94.2% ～105.5%；检出限和定量限分别为0.09和0.30 ng/支，应用本方法对14个不同类型市售卷烟和2R4F标准烟进行了测定，结果与GB/T21130-2007测定结果相符合。

在线液相-气相二维色谱；苯并［a］芘；卷烟；主流烟气

1 引言

苯并［a］芘是卷烟主流烟气中的重要有害成分，也是烟草安全评价的重要检测指标，国内外对卷烟主流烟气中苯并［a］芘的测定进行过深入研究，目前已得到实际应用的是GC-MS法［1～4］和HPLC-FLD法［5～9］。由于卷烟主流烟气成分复杂，苯并［a］芘的含量又属于痕量，样品基质中又存在大量的干扰物质，因此卷烟烟气中苯并［a］芘的测定都需要通过复杂的样品处理，前处理方法主要有溶剂提取、固相萃取或凝胶色谱（GPC）净化［10，11］等方法。这些方法样品前处理需多次的浓缩、转移，操作非常麻烦，可引入实验误差的因素多；而且耗费大量有机溶剂，对环境污染大。

在线液相-气相二维色谱是近几年来发展起来的新分析技术［12～15］，样品先经液相色谱分离净化后，含待测组分的流出馏分在线切割进入气相色谱进行分析。液相色谱和气相色谱的在线联用能充分发挥两级色谱的互补性，液相色谱的高柱效大大提高了样品的净化效果，能实现复杂基体中痕量待测成分与干扰物质的分离，而且二维色谱间在线切换还可减少样品前处理过程中的浓缩和转移，减少了人为分析误差，使分析结果的准确性、精密度大大提高。该技术在复杂基体中的痕量有机化合物分析领域得到了广泛应用。卷烟主流烟气中苯并［a］芘的测定采用硅胶固相萃取净化，气相色谱-质谱法测定（Coresta推荐方法和中国国标方法），样品前处理过程需大量使用有机溶剂，多次转移和浓缩，操作非常麻烦。本研究对岛津公司的在线凝胶气质联用仪进行了改进，将仪器上的微型凝胶柱换成微型硅胶柱，样品经过硅胶柱净化后，再进行气相色谱-质谱联用分析，建立一种在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中苯并［a］芘方法，方法简便、快速，结果令人满意，为卷烟主流烟气中苯并［a］芘的测定提供了新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

在线GPC（LC-20AD）-GC/MS（QP 2010 Plus）联用仪（日本岛津公司）；SM450型20孔道直线型吸烟机（英国Cerulean公司）；KQ-500DB超声波清洗器（上海越众仪器设备有限公司）。

苯并［a］芘标准品、D12-苯并［a］芘（纯度＞98%，美国Aldrich公司）；环己烷（色谱纯，美国DIKMA Pure公司）。

肯塔基参比卷烟样品1种（2R4F，美国肯塔基大学）。市售卷烟样品14种（混合型与烤烟型分别为6和8种），盒标烟气焦油量在3～12 mg/支。

2.2 实验方法

2.2.1 标准溶液的配制 苯并［a］芘标准溶液的配制:准确称取10.0 mg苯并［a］芘，用环己烷溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得到0.1 mg/mL苯并［a］芘储备液；使用时用环己烷稀释成所需浓度的标准工作液。D12-苯并［a］芘内标溶液:准确称取D12-苯并［a］芘10.0 mg，用环己烷溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得0.1 mg/mL的内标工作液。

2.2.2 卷烟主流烟气的捕集 卷烟样品在（22±1）℃、相对湿度60%±2%条件下平衡48 h，挑选平均重量±0.02 g和平均吸阻±49 Pa范围内的烟支作为测试样品。参照GB/T5606.1-2004［16］、GB/T19609-2004［17］的规定，采用SM450型20孔道直线型吸烟机用44 mm剑桥滤片捕集4支烟的主流烟气总粒相物。

2.2.3 样品处理和分析 将滤片放入50 mL锥形瓶中，加入D12-苯并［a］芘内标溶液200 μL，加入环己烷10 mL，超声萃取40 min，静置待用。萃取液经0.25μm滤头过滤后，按设定的仪器工作条件进行测定。

GC/MS条件:GC带柱头大体积进样附件（图1），保留间隙柱为5 m×0.53 mm（J&W）的空柱，预保留柱规格为5 m×0.25 mm×0.25μm，DB-5 ms（J&W）；主分析柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m ×0.25 mm ×0.25μm）；色谱柱升温程序:初始温度150℃，以10℃/min速率升至260℃，再以2℃/ min速率升至280℃，保持20 min；进样口温度280℃，载气为氦气，恒流流速l.2 mL/min。

质谱条件:选择离子检测（SIM），苯并［a］芘与D12-苯并［a］芘的保留时间分别为19.65和19.57 min，定量离子对分别为m/z 252和264，每个离子停留100 ms。

液相色谱带紫外检测器（λ=383 nm）:UHP AQ Si色谱柱（150 mm×2 mm，3.5μm，微孔球形硅胶）；柱温30℃恒温；流动相为环己烷-丙酮（20∶1，V/V），流速0.1 mL/min；双泵系统，泵A用于控制色谱柱流量，泵B用于控制HPLC与GC之间的切换。液相色谱进样量为50 μL，收集时间为6.8～8.6 min，并通过泵B和切换阀全部在线切换到GC的进样口。

3 结果与讨论

3.1 在线液相-气相二维色谱装置

在线液相-气相二维色谱装置结构示意图（见图1），样品通过进样器进入高效液相色谱仪，由泵A输送流动相经微型硅胶柱分离，所需要的馏分（含苯并［a］芘部位）通过数控六通阀转入捕集盘管，泵A流动相废液从六通阀6排出，泵B输送流动相把捕集盘管中所需要的馏分输送到气相色谱预柱中，在气相色谱预柱和分析柱之间有溶剂排出阀见图1，一级色谱（LC）切入样品真空蒸发排出溶剂后，再升温气化由载气输送进入分析柱，经分析柱分离后再通过质谱检测［18］。

3.2 萃取方式和萃取时间的确定

苯并［a］芘为低极性化合物，因此本实验中采用环己烷作为萃取溶剂。比较了振荡萃取、超声萃取和加热回流提取等方法提取样品中的苯并［a］芘。结果表明，加热回流提取操作繁琐，超声萃取效率明显优于振荡萃取，因此本实验选用超声萃取。比较了不同萃取时间（10，20，30，40，50和60 min）对苯并［a］芘提取效果的影响（图2）。结果表明:苯并［a］芘的释放量随萃取时间的延长而增多，在40 min时达到最大，再延长萃取时间对苯并［a］芘的释放量没有明显的影响，所以本实验选择超声萃取时间为40 min。

3.3 液相色谱柱的选择

考虑到卷烟主流烟气中苯并［a］芘的测定采用硅胶柱层析净化，本实验采用UHP AQ Si色谱柱（150 mm ×2 mm，3.5μm，微孔球形硅胶）为液相色谱的分离柱，流量0.1 mL/min，与常规的硅胶固相萃取净化相比，大大节约了有机流动相。由于苯并［a］芘和卷烟烟气中的主要共存物 （酚类、烟碱类似物、烃类等）极性差异比较大，用硅胶正相色谱能分离大部分的干扰组分，从而实现样品的净化。

图1 在线液相-气相二维色谱系统示意图Fig.1 Schematic diagram of on-line comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatographic system

考虑到从液相色谱切入气相色谱的馏分需排除溶剂后才能进行气相色谱分析，液相色谱需采用易挥发的流动相，因此本实验中采用环己烷和丙酮作为流动相，当环己烷与丙酮体积比为20∶1时，苯并［a］芘有较好的净化效果，因此实验选用该流动相，流速为0.1 mL/min，出峰时间为7.1～8.3 min（图3），考虑到收集定量环体积为200μL，最多只能切换200 μL的馏分进入气相色谱，为保证高浓度的样品能够完全收集，本实验选择收集时间为6.8～8.6 min。

图2 萃取时间对苯并［a］芘释放量的影响Fig.2 Effect of extraction time on benzo［a］pyrene （B［a］P）release quantity

图3 液相色谱净化的色谱图Fig.3 Chromatogram ofliquid chromatographic purification

3.4 GC-MS条件的选择

对色谱和质谱条件分别进行了优化，色谱条件主要对升温程序进行了优化，考察了不同升温程序的分离效果，以苯并［a］芘完全分离并尽可能缩短分析时间为目标，最终选择了2.2.3节中的升温程序。以苯并［a］芘达到最高响应为目标，对质谱条件进行了优化，最终选择离子源温度230℃，传输线温度280℃，扫描质量范围50～400 amu，扫描间隔0.5 s。采用从总离子流图提取单离子的方法进行定量分析，苯并［a］芘定量离子为m/z 252，内标特征离子为m/z 264。在选定条件下，标样和样品的色谱图见图4。

图4 苯并［a］芘和内标的气相色谱-质谱分析色谱图Fig.4 Chromatograms of gas chromatography-mass spectrometric analysis for B［a］P and internal standard

3.5 工作曲线、检出限和定量限

配制不同浓度的系列标准工作液，按选定仪器条件绘制工作曲线。标准曲线的每一点进样3次，取其峰面积的平均值为纵坐标，标样浓度为横坐标，回归方程A=12.85C+0.173，相关系数为0.9997，线性范围为0.08～50 ng/L。对最低浓度的苯并［a］芘标准溶液进行10次测定，计算其标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限，10倍标准偏差作为定量限，分别为0.09和0.30 ng/支。

3.6 方法回收率和重复性

卷烟2R4F样品4份，其中1份为参比，另3份分别加入高、中、低不同浓度水平的苯并［a］芘，样品按2.2节的前处理方法处理，选定色谱条件进样分析，得到苯并［a］芘的回收率在94.2% ～105.5%之间（表1），说明方法回收率较好。将参比卷烟2R4F重复分析6次，测得苯并［a］芘含量为7.21 ng/cig，其相对标准偏差（RSD）为2.7%，表明方法的重复性良好，满足日常烟气样品的检测。

表1 2R4F卷烟样品主流烟气中苯并［a］芘的回收率Table 1 Recovery rate of benzo（a）pyrene in cigarette mainstream smoke of 2R4F samples

3.7 卷烟样品主流烟气中苯并［a］芘分析结果

采用本方法和烟草行业标准方法GB/T21130-2007［19］中规定的方法对14个不同类型市售卷烟和2R4F卷烟样品进行测定，结果见表2。由表2可知，本方法的测定结果与国标方法GB/T21130-2007的分析结果具有较好的一致性，标准卷烟样品2R4F数据也与文献［20］报道值（6.96 ng/cig）基本一致，说明本方法准确可靠。

表2 14种卷烟样品中苯并［a］芘的测定结果Table 2 Determination results of benzo［a］pyrene in 14 kinds of cigarette samples

续表2（Continued to Table 2）

4 结论

基于在线液相-气相二维色谱联用技术，建立了测定卷烟主流烟气中苯并［a］芘的新方法。采用微型硅胶柱净化减少了溶剂消耗和环境污染，降低了实验成本。每次进样可达40 μL，与常规气相色谱相比，进样量扩大了20倍以上，灵敏度也显著提高，同时避免了样品处理过程中的浓缩、转移、定容等前处理步骤，减少了实验误差，由于样品处理人工操作环节大大减少，方法的重现性和灵敏度明显提高。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21365026）

Determination of Benzo［a］pyrene in Mainstream Cigarette Smoke by Online Comprehensive Two-dimensional Liquid-Gas Chromatography

LIU Chun-Bo，SHEN Qin-Peng，ZHANG Feng-Mei，ZHANG An-Feng，HE Pei，SI Xiao-Xi，LIU Zhi-Hua，YANG Guang-Yu*，MIAO Ming-Ming
（Key Lab of Tobacco Chemistry of Yunnan，Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming 650231，China）

An online comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatography method was developed to determine the benzo［a］pyrene（B［a］P）in mainstream cigarette smoke.The B［a］P in mainstream cigarette smoke was collected by a cambridge filter pad，then the pad was extracted with cyclohexane and the extract was quantitatively analyzed by online LC-GC/MS with B［a］P-D12 as an internal standard.After direct injection into the performance liquid chromatography，the benzo［a］pyrene in the samples were separated by micro silica gel column and cut into the gas chromatography.After draining the solvent，the benzo［a］pyrene was separated by capillary column gas chromatography warming and detected by mass spectrometry detection. By using silica gel column chromatography and gas chromatography-mass spectrometry in combination，the benzo［a］pyrene in the mainstream cigarette smoke was directly detected without any sample pretreatment.The sample injection volume of the method could reach 40 μL each time，which was far greater than that of conventional gas chromatography-mass spectrometry（2.0 μL of sample injection volume），resulting in an increasing analysis sensitivity of 20 times.The linearity range of the method（R2=0.999）was in the range of 0.08 ng/L to 50 ng/L.The recoveries at three spiked levels ranged from 94.2%to 105.5%and the limit of detection was 0.09 ng/cig.This method was applied for the determination of benzo［a］pyrene in 14 kind cigarettes in Chinese marked and the reference cigarettes 2R4F，and the determination results were consistent with GB/T21130-2007 method.

Online comprehensive two-dimensional liquid-gas chromatography；Benzo［a］pyrene；Cigarette；Mainstream smoke

21 August 2015；accepted 5 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150666

2015-08-21收稿；2015-11-05接受

本文系国家自然科学基金（No.21365026）资助项目

* E-mail:ygy1110@163.com