金匮肾气丸对自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R、β3—ARmRNA及其蛋白表达的影响

鲁湘鄂+吴清和

【摘 要】 目的：观察金匮肾气丸对自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R、β3-AR mRNA和蛋白表达的影响。方法：以多尿自然衰老大鼠为“肾虚多尿”模型，给予金匮肾气丸4周，采用酶消化和组织块相结合的方法原代培养逼尿肌细胞，用实时荧光定量PCR法和Westernblotting法观察金匮肾气丸对自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R、β3-AR mRNA及其蛋白表达的影响。结果：与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R mRNA和蛋白的表达明显增加；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R mRNA和蛋白的表达；与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-AR mRNA和蛋白表达明显降低；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-ARmRNA和蛋白的表达。结论：金匮肾气丸可以减少自然衰老大鼠膀胱逼尿肌细胞M3RmRNA及其蛋白的表达和增加自然衰老大鼠膀胱逼尿肌细胞β3-ARmRNA及其蛋白的表达，使M3R和β3-AR之间的平衡状态维持正常的水平。

【关键词】 金匮肾气丸；自然衰老大鼠；M3R；β3-AR

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0050-03

Abstract：Objective To observe the impacts of “Jinkui Shenqi pill” on the expression of M3R and β3-AR mRNA and corresponding proteins in the Bladder detrusor cells of Natural aging rat. Methods Natural aging rats were used as “kidney deficiency and urinary” model， then were treated with “Jinkui Shenqi pill”. for 4 weeks and Detrusor cells were cultured by the combination of Enzyme digestion and tissue.The expression of M3R and β3-AR mRNA in the bladder detrusor cells by realtime fluorescence quantitative PCR method was investigated. The expression of M3R and β3-AR proteins in the bladder detrusor cells by Westernblotting was investigated.Results In model rats， the expression of M3R mRNA and corresponding proteins increased and the expression of β3-ARmRNA and corresponding proteins decreased in the Bladder detrusor cells. “Jinkui Shenqi pill” could decreased the expression of M3R mRNA and corresponding proteins，increased the expression of β3-AR mRNA and corresponding proteins in the bladder detrusor cells of Natural aging rat.Conclusion Jinkui Shenqi pill”could make M3R mRNA and corresponding proteins expression of detrusor cells of the natural aging rats decreased，and β3-AR mRNA and corresponding proteins expression of detrusor cells of the natural aging rats increased.

Keywords：Jinkui Shenqi pill； natural aging rat ； M3R；β3-AR

金匮肾气丸由地黄、茯苓、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、桂枝、牛膝、车前子、附子等药材组成，具有温补肾阳、化气行水的功效，用于肾虚水肿、腰膝酸软、小便不利、畏寒肢冷。膀胱的生理功能是贮存和排尿，尿液在膀胱内贮存到一定限度时，即可及时自主地排出体外[1]。β3受体直接介导逼尿肌松弛，M3受体直接参与了逼尿肌收缩。膀胱逼尿肌的舒张和收缩功能异常可直接导致下尿路功能症状的出现，其发病率随年龄增加而上升[2]。研究在自然衰老大鼠模型上观察M3R、β3-AR mRNA及其蛋白的表达变化及金匮肾气丸对其的影响，以揭示金匮肾气丸影响尿功能的分子机制。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 SD自然衰老大鼠（15月龄），SPF级，雌雄各25只，雌鼠体重320～400g，雄鼠体重440～520g；SD大鼠（3月龄），SPF级，雌雄各5只，雌鼠体重160～180g，雄鼠体重200～220g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0020，合格证号：0089418，0086829，0086847。

1.2 实验药物 金匮肾气丸（批号：0030377，北京同仁堂科技股份有限公司），参照Bios氏原法折算大鼠用药剂量，以临床用量折算等效剂量为中剂量，低、中、高剂量分别为0.54、1.08、2.16g/（kg·d）。缩泉胶囊（批号：100302，湖南汉森制药有限公司），以临床用量折算等效剂量为中剂量，为 0.585 g/（kg·d）。

1.3 仪器 TL-4显微镜（Olympus公司）；ABI实时定量PCR仪（爱普拜斯应用生物系统贸易有限公司）；电泳装置和转膜装置（美国Bio-Rad）；IB高速低温离心机（德国eppendorf公司）；AS图像分析系统（德国Kontron elekronik公司）；核酸蛋白分子仪（德国Beckman公司）；脱色摇床（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JA1203N型电子天平（上海精密仪器有限公司）。

1.4 主要试剂 DMEM、双抗、胎牛血清、Ⅳ胶原酶、胰酶均为美国GIBCO公司产品； D-hank、PBS均为上海吉诺生物公司产品；总RNA抽提试剂Trizol（美国MRC公司）；逆转录试剂cDNA试剂盒、实时荧光定量PCR试剂、细胞裂解液、PrestainTM蛋白质预染Markers均为加拿大Fermentas公司产品；M3R、β3-AR、GAPDH引物由上海生工生物有限公司提供；BCA蛋白定量试剂盒、SDS、考马斯亮蓝R250均为广州美津生物技术有限公司产品；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、SDS-PAGE Tricine蛋白上样缓冲液均为武汉博士德公司产品；DEPC、甘氨酸、Tris、甘油、溴酚蓝、Tween-20均为美国Amresco公司产品；脱脂奶粉（广州斯佳生物科技有限公司）；Rabbit Anti-PKA抗体（美国upstate公司）；H-89、Goat anti-Rabbit IgG（H+L）HRP、immobilonTM western、Immobilon-P PVDF膜均为美国millipore公司产品；β-actin抗体（美国santa公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药 取筛选合格的自然衰老大鼠（15月龄）50只，青年大鼠（3月龄）10只，雌雄各半。设置组别为：正常对照组10只，模型对照组、缩泉胶囊组、金匮肾气丸高、中、低剂量组 10只/组。缩泉胶囊组、金匮肾气丸高、中、低剂量组分别按1ml/100g连续灌胃给药4周，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水。

2.2 原代逼尿肌细胞的培养[3]取SD大鼠，断头处死，75%酒精灭菌消毒，无菌条件下取膀胱，放入有PBS和双抗的培养皿中，于显微镜下剔除粘膜及结缔组织，漂洗2次；取400UL的D-hanks液，放入1.5ml的无菌eppendorf管中，将无菌的膀胱放入EP管中，剪成1mm3左右碎块，1500r离心3min，重复2次，弃上清液；加1mL0.1%Ⅳ型胶原酶，放入37℃培养箱内孵育1h；取出，强力吹打，1500r离心3min，弃上清夜，加入1ml DMEM培养液重新悬浮细胞和组织，1500r离心3min，重复3次，弃上清夜，用含20%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞和组织；将培养瓶置于37℃，95%O2和5%CO2混合气体的培养箱中，3～5d换液一次；细胞覆盖大部分表面以后传代，吸弃旧培养液，沿培养瓶细胞面对侧加入PBS，清洗细胞，倒掉PBS，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶，轻轻摇动使消化液流遍所有细胞表面，消化15～30s后把培养瓶放置在倒置显微镜下进行观察，可发现胞质回缩、细胞间隙增大；倒掉消化液，加少许培养液终止消化，弯头吸管反复轻柔吹打瓶底细胞后，分装接种。5天后可再传代。

2.3 逼尿肌细胞M3R、β3-AR mRNA表达 取1×107逼尿肌细胞，PBS漂洗两遍，按照试剂盒说明书，Trizol法提取总mRNA，逆转录合成cDNA。PCR扩增反应，引物采用Primer Express3.0 软件设计3对引物。引物M3R-F：cggttccactacctacatcattatgaaccg，M3R-R：gacagcgaccgtacttcctcct，扩增片段为566 bp；β3-AR-F： atcgagaccctgtgcgccct，β3-AR-R：Tgggtgtcccgactgtggca t，扩增片段为427bp。选择GAPDH为内参照，扩增片段为273bp。扩增程序：预处理（50℃，2min），预变性（95℃，10min），以上两步一个循环。变性（95℃，15s），退火（60℃，30s）及延伸（72℃，30s），以上三步为一个循环，如此进行40个循环。采用7500 system software分析结果，得出各组内参基因和目的基因的Ct值。

2.4 逼尿肌细胞M3R，β3-AR 蛋白表达 取1×107逼尿肌细胞，PBS漂洗两遍，弃去，加入300μl蛋白裂解液，轻轻吹打，裂解细胞。收集细胞裂解液于1.5ml eppendorf管中，4℃ 14000g离心15min。取上清液可分装-20℃保存备用。取上清，过夜转膜后，在摇床上室温封闭2h，PVDF膜置于新鲜配制的含一抗或内参一抗的封闭液孵育 1h，TBST 洗膜3次，加入二抗孵育1h，TBST 洗膜3次，将化学发光试剂加于膜上，成像系统下进行曝光，使用图像分析软件对条带灰度分析，计算目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值作为半定量结果。

2.5 统计方法 数据采用SPSS15.1统计软件处理，数据以（x±s）表示，组间比较用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 金匮肾气丸对自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R、β3-AR mRNA的影响 与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R mRNA的表达明显增加；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R mRNA的表达。与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-AR mRNA表达明显降低；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-AR mRNA的表达。见表1。

3.2 金匮肾气丸对自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R、β3-AR 蛋白表达的影响 与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R蛋白表达明显增加；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以抑制自然衰老大鼠逼尿肌细胞M3R 蛋白的表达。与正常对照组比较，自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-AR蛋白表达明显降低；与模型对照组比较，金匮肾气丸可以增加自然衰老大鼠逼尿肌细胞β3-AR mRNA的表达。见表2，图1。

4 讨论

与排尿活动相关的受体：肾上腺素能受体分为α-受体和β-受体，胆碱能受体。α-受体主要分布于膀胱底部、颈部和后尿道平滑肌，其受刺激引起膀胱颈和后尿道收缩，阻止尿液排出。β-受体主要分布于膀胱体部平滑肌，受刺激后使膀胱弛张，便于尿液贮存，且以β3-AR为主。胆碱能受体分布于整个膀胱及后尿道，受到刺激后增加膀胱逼尿肌收缩力，促使排尿，且以M3受体为主。Nishimoto[4]等报道老年大鼠膀胱β-AR的密度随年龄增加而逐渐降低，说明β-AR可能与老龄膀胱功能障碍有关。Kolta[5]等报道自然衰老大鼠M3R mRNA的表达随着年龄的增加而增加，膀胱储存尿液容量减少，导致尿液不自主的排泄，产生多尿、尿频等症状。金匮肾气丸显著增加了自然衰老大鼠膀胱逼尿肌上β3-AR mRNA及其蛋白的表达，抑制自然衰老大鼠膀胱逼尿肌中M3R mRNA及其蛋白的表达，可以有效地舒张膀胱逼尿肌，增加膀胱的有效容量，从而减少尿量的排出。自然衰老大鼠M3R的增加能够抑制β3-AR产生一系列的信号转导反应，即M3R的上调削弱了β3-AR的舒张效应，导致M3R功能相对亢进，逼尿肌不自主的收缩，引起老年大鼠多尿。因此M3受体和β3-AR受体之间的平衡状态对于维持正常的膀胱功能极为重要。

本研究从分子水平说明自然衰老大鼠多尿可能与膀胱逼尿肌细胞M3R的增加和β3-AR的减少有关，而金匮肾气丸可以减少自然衰老大鼠膀胱逼尿肌细胞M3R mR NA及其蛋白的表达和增加自然衰老大鼠膀胱逼尿肌细胞β3-AR mRNA及其蛋白的表达，使M3R和β3-AR之间的平衡状态维持正常的水平，恢复膀胱的贮尿和排尿两个重要的生理功能。

参考文献

[1]姚泰.生理学[M].北京：人民卫生出版社，2001：275-312.

[2]张玉海.膀胱排尿功能障碍[M].北京：人民卫生出版社，2000：19-21.

[3]宋今丹.组织和细胞培养技术[M].北京：人民卫生出版社，2004：5.

[4]Nishimoto T，Latifpour J，Wheeler MA，et al.Age-dependent alterations in beta-adrenergic responsiveness of rat detrusor smooth muscle[J].J Urol，1995，15（3）：1701-1705.

[5]Kolta MG，Wallace LJ，Gerald MC.Age-related changes in sensitivity of rat urinary bladder to autonomic agents[J].Mech Ageing Dev，1984，27（2）：183-188.

（收稿日期：2016.04.25）