基于GC-MS的心肌缺血大鼠血浆中内源性代谢物测定方法的建立△

徐文杰陈　颖

（1.广东省第二中医院

（广东省中医药工程技术研究院），广东省中医药研究开发重点实验室广州510095；2.广东食品药品职业学院广州510520）

基于GC-MS的心肌缺血大鼠血浆中内源性代谢物测定方法的建立△

徐文杰1陈颖2*

（1.广东省第二中医院

（广东省中医药工程技术研究院），广东省中医药研究开发重点实验室广州510095；2.广东食品药品职业学院广州510520）

目的：建立GC-MS测定心肌缺血大鼠血浆中内源性代谢物的方法。方法：皮下注射异丙肾上腺素复制大鼠心肌缺血模型，采用DB-5MS Ultra Inert（30m×250μm，0.25μm）色谱柱，GC-MS进行程序升温，氦气（纯度>99.999％）为载气；无分流进样；流速为1mL·min-1；进样口温度设为250℃；进样量为2μL。质谱参数：离子源温度设为230℃；电子能量为70eV；电子倍增器电压1847V；电离方式EI。质谱采用全扫描方式（扫描范围30～550m/z）进行数据采集。自建对照品物质库，并参考气质工作站的数据库对内源性生物标志物进行鉴定指认，然后进行方法学考察，包括精密度、重现性、稳定性。结果：仪器与方法精密度、重复性和稳定性试验的相对峰面积RSD值均小于20％。结论：该方法快速、灵敏、准确、重复性好，可用于心肌缺血大鼠血浆中内源性代谢物的测定，该方法可应用于心肌缺血模型的代谢组学研究。

大鼠 检测方法 GC-MS 心肌缺血 代谢组学

近年来，气相色谱/质谱联用技术（GC-MS）具有灵敏度好、费用低、色谱性能较好等优点，已被广泛应用于植物代谢组学、微生物和临床代谢组学研究[1]，加上其庞大化合物谱图库为鉴定工作带来了很大的便利，能提供定量和定性的信息，在代谢组学研究中显示出突出的优势。代谢组学研究的对象主要是动物体液中的代谢物，如血液、尿液中的糖类，氨基酸，脂肪酸，甾体类物质，胺类[2～3]，这些物质的共同特征是极性强、挥发性低，所以往往不能直接进样分析，需进行适当的化学处理将其转化成挥发性衍生物，使其适用于气相色谱进行分离分析，此方法不仅可以扩大气相色谱的测定范围，而且转化成衍生物后，生物样品中结构极其近似的化合物更易被区分，同时还可解决载体、柱壁对高极性、低挥发性样品的吸附问题，改善样品的峰形[4]。

本文采用气相色谱/质谱联用（GC-MS）技术，复制大鼠心肌缺血模型，建立大鼠血液中内源性代谢物的测定方法，获得每个峰的质谱图，通过每个峰代表的化合物的分子结构碎片峰的类型和m/z，结合质谱数据库进行鉴定。然后进行方法学考察，并将其应用于心肌缺血模型的代谢组学研究。

1　仪器与材料

1.1仪器：HP6890GC/5973MS型气相色谱质谱联用仪（惠普公司，美国）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；JJ 3000型动物电子天平（G&C公司）；十万分之一电子天平（美国DENVER公司）；3K30型低温高速离心机（sigma公司，德国）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SANYO MDF-382型超低温冰箱（日本SANYO公司）；HH-6数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）。

1.2试药：5-羟色胺、苯丙氨酸、蛋氨酸、庚二酸、丙酮酸、3-吲哚乙酸等均购于阿拉丁试剂公司。盐酸异丙肾上腺素注射液（ISO，规格：2mL：1mg，购于西南药业股份有限公司）。吡啶、无水硫酸钠、氯甲酸乙酯（ECF）、氢氧化钠、氯仿、无水乙醇、乙醇等均购于成都化夏化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.3动物：雄性Wistar大鼠，清洁级，体重180～220g，由广东省医学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK粤2015-0015。动物实验环境：广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）SPF级动物实验室，环境设施使用许可证号：SYXK（粤）2015-0059。控制室内温度为（22±2）℃，相对湿度40％～50％，大鼠给予标准饲料和饮用水，于室内保持12h光照、12h避光循环饲养。

2　方法与结果

2.1标本采集与预处理：大鼠预先适应2周后开始实验。参考文献方法[5]，大鼠每天皮下注射异丙肾上腺素（2mg·kg-1），连续10d，大鼠取样前禁食12h，但可自由饮水。实验过程中观察大鼠行为学特征。d11早晨由眼眶采集全血250μL，置于含有EDTA-2Na的试管中，于4℃低温离心机中13000rpm离心10min，取血浆置于含有EDTA-2Na的试管中，置于-80℃冰箱保存备用，用于代谢组学的分析，测定血浆样品中内源性小分子代谢物。

2.2供试品溶液制备[6]：血浆于37℃水浴快速解冻，精密吸取100μL血浆于EP管中，添加400μL无水乙醇、100μL吡啶和50μL ECF，静置1min，置XW-80A型旋涡混合器振荡1min，加入300μL氯仿，继续振荡30s，静置5min，置3K30型低温高速离心机中3000rpm离心5min，取出后加入100μL 10mol·L-1NaOH，继续加入50μL ECF，振荡30s，3000rpm离心10min，吸去上层水层，往氯仿层添加少量无水硫酸钠除去多余水分，吸取适量溶液用0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，置4℃冰箱备用，待后续进行GC/MS分析。

2.3GC-MS分析条件：色谱柱：DB-5MS Ultra Inert（30m× 250μm，0.25μm）；采用升温程序模式：70℃（2.0min），70～300℃线性升温（5℃·min-1），300℃（2.0min）；进样量为2μL；流速为1mL·min-1；无分流进样；载气为氦气（纯度>99.999％）；进样口温度设为250℃。质谱参数：离子源温度230℃；电离方式EI；电子能量70eV；电子倍增器电压1847V。质谱采用全扫描方式（扫描范围30～550m/z）进行数据采集。心肌缺血大鼠血浆GC/MS总离子流图如图1所示。

2.4代谢物的鉴定：自建对照品物质库及查询网站（http：//metlin. scripps.edu/metabo_search_alt2.php和http：//www.hmdb.ca/），并运用气质工作站的数据库（WILEY 275.L及NIST05.L），对内源性生物标志物进行鉴定，选择匹配度较高的内源性生物标志物作为鉴定结果。

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验：取同一份血浆样品溶液，按照“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，按照“2.3”项下GC/MS测定方法连续进样6次，选取若干丰度较大的代谢物为考察对象，计算相对峰面积（A）及考察一致性，计算相对标准偏差（RSD），结果见表1。结果显示，考察的相对峰面积RSD值均小于20％，该方法精密度尚可。

表1　精密度试验结果

2.5.2重复性试验：取同一份血浆样品溶液，按照“2.2”项下方法平行操作制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下GC/MS测定方法进样，选取若干丰度较大的代谢物为考察对象，计算相对峰面积（A）及考察一致性，计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。结果显示，考察的相对峰面积RSD值均小于15％，表明该制备方法可靠。

表2　重复性试验结果

2.5.3稳定性试验：取同一份供试品溶液，按照“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20、24h按照“2.3”项下GC/MS测定方法进样，选取若干丰度较大的代谢物为考察对象，计算相对峰面积（A）及考察一致性，计算相对标准偏差（RSD），结果见表3。结果显示考察的相对峰面积RSD值均小于15％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表3　稳定性试验结果

3　讨论

3.1动物体液（如血液、尿液、组织液、唾沫等）中代谢物（如胺类、氨基酸、糖类、甾体类、脂肪酸类等物质）是代谢组学研究的主要对象，体液中干扰分析的主要成分是蛋白质[7]，其存在会对色谱柱和检测器造成损害而且会增大检测误差。样品提取是GS/MS代谢组学研究的关键步骤，从体液中提取内源性小分子代谢物具有一定困难。根据文献[8]报道，去除蛋白质的方法有甲醇（或乙腈）沉降法和离心沉降法，预试验时比较了两种处理方法的效果，两种处理方法的效果相差不多，一些特定物质在有机溶剂中的溶解度不高，因此经甲醇（或乙醇）处理的样品在质谱上得到的信息有所减少，故不采用此方法进行蛋白质去除。最终确定了以13000rpm对血样进行离心，这样可以基本去除杂质。采用此方法的前处理步骤较为简单，且不影响分析结果。

3.2生物样本中代谢组种类和数量繁多，理化性质悬殊，浓度差异巨大，动物体液中的代谢物共同特征是极性强、挥发性低，兼顾不同性质的化合物，因此提取方法要尽可能多地提取出生物样本中的内源性小分子代谢物，使样品中完整的代谢物组分信息得以保留和体现。为了尽可能多地检测到这些物质，同时保持样品前处理过程简单准确，本文选择ECF为衍生化试剂，经过一系列适当的化学处理，将这些极性强、挥发性低的物质转化成挥发性衍生物，使生物样品中结构极其近似的化合物更易被区分。该衍生化试剂与酚、胺的衍生反应可以在水相中进行，衍生产物是碳酸酯和氨基甲酸酯，衍生产物色谱性能优良。不需要将血液蒸干到无水状态是该方法最大的优点，大大降低了前处理的时间和难度。

3.3通过方法学研究，本文建立的基于GC/MS的代谢组学研究方法，重复性好、精密度高，适用于快速的高通量检测。采用该方法对血样溶液进行测定，峰分离度、分辨率以及峰形都具有较好的结果。

[1]辜雪琴，范国荣，陆峰，等.气相色谱-质谱代谢组学研究关键技术及典型应用[J].中国医药工业杂志，2015，46（1）：68-73.

[2]Trethewey RN，Krotzky AJ，Willmitzer L.Metabolic profiling：a rosetta stone for genomics[J].Curr Opin Plant Biol.1999，2：83-85.

[3]Fiehn O，Kopka J，Dormann P，et al.Metabolite profilingfor plant functional genomics[J].Nat Biotechnol.2000，18：1157-1161.

[4]熊喜悦，盛小奇，王华，等.代谢组学气相色谱-质谱分析方法中样品衍生化技术的新进展[J].化学通报，2015，78（7）：602-607.

[5]Santo HC，Brenner G，Mayfield ED Jr.Studies on isoproteronol induced cardiomaegaly in rat[J].Am Heart J，1969，77：72-80.

[6]谢国祥.基于几种色谱分析方法的生物样本的代谢组学研究[D].上海：上海交通大学，2006：46.

[7]夏鑫华，刘梅，李欢.基于衍生化反应和GC-MS技术测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物轮廓谱[J].中华中医药学刊，2012，30（1）：41-43.

[8]蔡品品，卢红梅.气相色谱-质谱分析血清代谢组前处理中的除蛋白及衍生方法[J].分析化学，2013，41（8）：1183-1187.

△基金课题：广东省中医药局建设中医药强省科研项目（No. 20152016）

Determination of endogenous metabolites in plasma of myocardial ischemia rat model by GC-MS

Xu Wenjie1Chen Ying2*（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital（Guangdong Province Engineering Technology Research InstituteofTraditionalChineseMedicine），GuangdongProvincialKeyLaboratoryofTraditionalChinese Medicine Research and Development，Guangdong Guangzhou，510095，China；2.Guangdong Food and Drug Vacational College，Guangdong Guangzhou，510520，China）

Objective：To establish a GS-MS method for determination of endogenous metabolites in plasma of myocardial ischemia rats. Methods：subcutaneous injection of isoproterenol replication model of myocardial ischemia rats，using DB-5MS Ultra Inert（30m×250m，0.25μm）column chromatography，GC-MS by temperature programmed，carrier gas was helium（purity>99.999％），the flow rate was 1mL·min-1;splitless injection;into the injector temperature of 250℃;sample injection volume was 2μL.MS parameters：ion source temperature was 230℃;EI ionization;electron energy of 70，electron multiplier voltage of 1847 V eV.MS scan mode wtih full data acquisition，and the scanning range of 30～550m/z.Using the database of temperament work station，combined with the self-built reference material library to identify endogenous biomarkers，select the endogenous biomarkers with high matching degree as the identification results.Results：Instrument and method precision，repeatability and stability test of relative peak area of RSD values were less than 20％.Conclusion：The method is rapid，sensitive，accurate，reproducible，and can be used for the determination of endogenous metabolites in plasma of rats with myocardial ischemia.The method can be applied to myocardial ischemia model of blood metabolic group study.

Rat Determining method GC-MS；myocardial ischemia model Metabonomics

R917

B

1672-8351（2016）10-0123-03