虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响

朱小丽，孙小凤，赖铭莹



·实验论著·

虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响

朱小丽*，孙小凤*，赖铭莹

•METHODS: Cultured RF/6A cells were divided into normal control group, high glucose group and high glucose (HG) + different concentration cordycepin groups (HG+10μg/mL group, HG+50μg/mL group, HG+100μg/mL group). The cell proliferation was assessed using cholecystokinin octapeptide dye after treated for 48h. The cell migration was investigated by a Transwell assay. The tube formation was measured on Matrigel. Furthermore, the impact of cordycepin on high glucose-induced activation of VEGF and VEGF receptor 2 (VEGFR-2) was tested by Western blot analysis.

•RESULTS: Compared with normal control group, cell viability markedly increased in high glucose group (P<0.05). Cordycepin inhibited RF/6A cell proliferation in a dose-dependent fashion: 10.2±0.9%, 23.4±1.5% and 31.1±1.2% inhibition as the concentrations of cordycepin were 10, 50 and 100μg/mL, respectively. The difference had statistically significant (P<0.05) compared with high glucose group. The number of cell migration were 55.6±2.70, 87.4±2.40, 65.4±2.7, 57.8±2.38, 62.4±2.77 in normal control group, high glucose group and HG+10μg/mL group, HG+50μg/mL group, HG+100μg/mL group respectively. Migration of RF/6A conspicuously increased in high glucose group(P<0.05) compared with normal control group; while showing a gradually reducing trend with the increase of cordycepin dose and a statistically significant difference compared with high glucose group(P<0.05). The number of tube formation were 18.7±2.08, 25.7±1.52, 19.9±1.57, 16.3± 2.51, 5.67±1.72 in the abovementioned group. Similarly showing a gradually reducing trend with the increase of cordycepin dose and a statistically significant difference with high glucose group (P<0.05). In addition, the number of tube formation of RF/6A in high glucose group significant increased compared with normal control group (P<0.05). The expression of VEGF and VEGFR-2 dramaticlly increased in high glucose groupvsnormal control group, oppositely gradually decreased with the increase of cordycepin concentrations, and had a statistically significant differencevshigh glucose group (P<0.05).

•CONCLUSION: Cordycepin can suppress the proliferation, migration and tubu formation of RF/6A in high glucose condition, might via inhibiting expression of VEGF and VEGFR-2.

目的：观察虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)血管新生作用的影响，探讨其可能的作用机制。

方法：培养RF/6A细胞，分为正常对照组(NC组)、高糖对照组(HG组)、高糖加不同浓度的虫草素组(HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组)。采用CCK8法检测各组细胞的增殖活性；采用Transwell实验检测各组细胞的迁移；采用Matrigel检测各组管腔形成的情况；采用Western-blot检测各组细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达的情况。

结果：与NC组相比，HG组RF/6A的增殖活性增加(P<0.05)。不同浓度的虫草素对RF/6A的增殖均有抑制作用，随着虫草素浓度增加，细胞活性下降。HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组的增殖活性抑制率分别为(10.2±0.9)%、(23.4±1.5)%、(31.1±1.2)%，与HG组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。NC组、HG组、HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组细胞迁移个数分别为55.6±2.70、87.4±2.40、65.4±2.7、57.8±2.38、62.4±2.77个。与NC组相比，HG组迁移细胞数量增加(P<0.05)；不同浓度虫草素组细胞迁移数量随着虫草素浓度的增加而减少，与HG组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。NC组、HG组、HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组的细胞管腔形成个数分别为18.7±2.08、25.7±1.52、19.9±1.57、16.3±2.51、5.7±1.72个。与NC组相比，HG组细胞管腔形成个数增加(P<0.05)；不同浓度虫草素组细胞管腔形成个数随着虫草素浓度的增加而减少，与HG组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比，HG组VEGF和VEGFR2蛋白表达的量增加(P<0.05)；不同浓度虫草素组中细胞内VEGF和VEGFR2蛋白表达的量均低于高糖对照组(P<0.05)。

结论：虫草素可能通过抑制高糖下VEGF和VEGFR2蛋白的表达，抑制RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成，进而抑制血管新生。

虫草素；高糖培养；恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞；血管内皮生长因子；血管新生

引用：朱小丽，孙小凤，赖铭莹.虫草素对高糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞血管新生的影响.国际眼科杂志2016;16(7):1237-1241

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见和严重的微血管并发症之一。DR发病机制复杂，其中以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)为主的促血管生长因子在眼部的过度表达是导致DR发生、发展的重要因素[1]。在DR病理过程中，高糖可导致视网膜血管内皮细胞过度分泌VEGF，引起血管内皮细胞损伤，血管渗透性增加，毛细血管闭塞，促进视网膜组织的缺血缺氧，最终引起新生血管的形成[2-3]。过度分泌的VEGF与其受体(主要是VEGFR2受体)结合磷酸化后，激活下游信号通路，诱导内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，导致新生血管形成增加[4]。虫草素是冬虫夏草中提取的单体，是虫草制剂作用的核心成分，最早用于肿瘤的治疗，近年来它的抗新生血管活性也逐渐受到关注。吉川纪子[5]于2005年通过体内实验发现，虫草素具有剂量依赖性抑制血管新生作用。蔡伟等[6]研究结果证明，虫草素能抑制结肠癌细胞质中VEGF的表达。但虫草素对VEGF和VEGFR2在血管内皮细胞上表达的影响还没有报道。本研究拟将体外培养的RF/6A置于高糖环境下，观察虫草素对其增殖活性、迁移、管腔形成及VEGF和VEGFR2蛋白表达的影响，为虫草素应用于DR提供实验研究的支持。

1材料和方法

1.1材料RF/6A细胞(中科院上海细胞库)；虫草素(美国Sigma公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰蛋白酶-ETDA消化液(美国Gibco)；青霉素、链霉素(Cyagen公司)；CCK8试剂盒(日本同仁公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；苏木精染色液(上海碧云天生物科技公司)；Matrigel(美国BD公司)；兔抗人VEGF多克隆抗体(美国NovusBiologicals公司)；KDR多克隆抗体(德国Giobal Biotech公司)；山羊抗兔IgG HRP(美国Abcam公司)；细胞恒温CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1 RF/6A细胞的培养采用含10% FBS和1%青链霉素双抗的25mmol/L高糖DMEM培养液和5.5mmol/L正常DMEM培养液分别作为生长培养基。将RF/6A细胞接种到75cm2培养瓶内，制成密度为5×105/瓶的细胞悬液，置于恒温37℃、体积分数5% CO2培养箱内培养，待细胞铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶-ETDA消化，按1∶2或1∶3分瓶传代，取生长良好的第3～4代细胞，用于下一步实验。

1.2.2细胞分组将细胞分为5组，分别为NC组：5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培养下的正常对照组；HG组：25mmol/L高糖DMEM培养下的高糖对照组；HG+10μg/mL组：在高糖组中加入10μg/mL虫草素；HG+50μg/mL组：在高糖组中加入50μg/mL虫草素；HG+100μg/mL组：在高糖组中加入100μg/mL虫草素。

1.2.3 CCK8检测RF/6A细胞增殖活性取对数生长期RF/6A细胞用于实验。按分组分别加入正常和高糖的DMEM培养液，制成细胞浓度为5×104个/mL的细胞悬液，每孔100μL，接种于96孔板上，每组6个复孔，共5组，边缘孔均用无菌PBS填充，置于37℃、5% CO2培养箱内孵育。24h后将其中三组的高糖培养基吸干，分别加入含不同浓度虫草素(10、50、100μg/mL)的高糖DMEM 100μL，各组培养48h后，吸去孔中的培养基，每天同一时间向每孔内加入含10%的CCK8(cell counting kit-8，CCK8)溶液的DMEM培养液100μL后放入恒温37℃、5% CO2培养箱继续培养2h，按操作说明用自动酶标仪测450nm波长下吸光度A值。相同条件下重复实验3次。细胞活性抑制率(%)=[(实验组平均A值-对照组平均A值)/对照组平均A值]×100%。

1.2.4 Transwell小室检测RF/6A细胞移行Transwell小室置于含10% FBS的DMEM培养液600μL的24孔板中，正常组为5.5mmol/L葡糖糖的DMEM培养液，高糖组和虫草素组为25mmol/L葡糖糖的DMEM培养液，接种RF/6A细胞于上室，密度为6×103/孔。每孔上室按不同分组加入含相应浓度虫草素的无血清培养基100μL。37℃、5%CO2培养箱培养24h后，取出小室，弃去培养液，用棉签轻轻擦掉小室上层未迁出的细胞，4%多聚甲醛固定小室20min,将小室适当风干后,0.1%结晶紫染色20min，PBS洗3次。细胞在400倍显微镜下随机取5个视野照相，所得细胞数的平均值用以统计分析。每组3个复孔，重复实验3次。

1.2.5 Matrigel检测内皮细胞管腔形成在4℃下提前融化Matrigel。取96孔板，每孔内缓慢加入100μL液态Matrigel(所有操作均在冰上进行)。消化RF/6A细胞，用正常和高糖DMEM培养基分别稀释为2×105个/mL细胞悬液。每孔加入50μL，设3个复孔，按不同分组每孔加入相应浓度的虫草素。孵育12h后在显微镜下观察，随机取5个不同视野照相，对形成的完整管腔计数，取平均值。每组设3个复孔，重复实验3次。

1.2.6 Western-Blot法检测各组RF/6A细胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表达六孔板正常和高糖DMEM培养液培养RF/6A细胞，虫草素组每孔中加入不同浓度的虫草素(10、50、100μg/mL)，高糖组和正常组不加虫草素，药物作用48h后，收集细胞。冰上超声波粉碎仪粉碎细胞，12000r/min，4℃离心30min，收集、测定并调节上清蛋白浓度后，SDS-PAGE电泳(150V电压)后转移至PVDF膜，5% BSA室温下封闭2h，VEGF及VEGFR2一抗(分别为1∶1000，1∶500)4℃下孵育过夜，TBST清洗3次，再以相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(均为1∶5000)37℃摇床孵育1h，TBST清洗3次。ECL显影液显色，用Bio-Rad凝胶成像系统成像后，图片用Image J软件分析条带的信号强弱，以GAPDH为内参照，计算蛋白的相对表达量。

2结果

2.1虫草素对RF/6A细胞增殖活性的影响CCK8结果显示，与NC组比较，HG组RF/6A细胞增殖活性明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。虫草素对RF/6A增殖有抑制作用，与HG组相比，HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组细胞活性抑制率分别为(10.2±0.9)%、(23.4±1.5)%、(31.1±1.2)%。随着虫草素浓度的增加，细胞活性下降，与HG组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各组间比较差异具有统计学意义(F组间=90.283，P<0.05，图1)。

2.2虫草素对RF/6A细胞迁移的影响Transwell实验结果显示，NC组、HG组、HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组细胞迁移个数分别为55.6±2.70、87.4±2.40、65.4 ±2.7、57.8±2.38、62.4±2.77个，各组间比较差异具有统计学意义(F=185.651，P<0.05)。与NC组相比，HG组细胞迁移个数明显增加(P<0.05)，与HG组相比，不同浓度虫草素对RF/6A细胞的迁移均有抑制作用，且随着虫草素浓度的增加，移行细胞个数逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.3虫草素对RF/6A细胞管腔形成的影响Matrigel实验结果显示，NC组、HG组、HG+10μg/mL组、HG+50μg/mL组、HG+100μg/mL组细胞的管腔形成个数分别为18.7±2.08、25.7±1.52、19.9±1.57、16.3±2.51、5.7±1.72个，各组间比较差异具有统计学意义(F=58.207，P<0.01)。与NC相比，HG组细胞管腔形成个数明显增加(P<0.05)。与HG组相比，不同浓度虫草素对RF/6A细胞的管腔形成均有抑制作用，且随着虫草素浓度的增加，管腔形成个数逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图1虫草素对高糖下RF/6A细胞活性的抑制作用aP<0.05vsNC组；cP<0.05vsHG组。

2.4各组RF/6A细胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表达Western-Blot实验结果显示,与NC组相比，HG组VEGF和VEGFR2蛋白表达相对增多(P<0.05)。与HG组相比，不同浓度虫草素对RF/6A细胞VEGF和VEGFR2蛋白表达均有抑制作用(P<0.05)，随着虫草素浓度的提高，VEGF和VEGFR2蛋白表达的量下降。各组间比较差异具有统计学意义(F=217.074，P<0.01，图4)。

3讨论

DR是糖尿病最常见的眼部微血管并发症，它已成为大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因。高血糖被认为是DR的危险因素，且高血糖的严重程度和持续时间与DR患病率和严重程度直接相关[7]。长期慢性高血糖，机体血管渗透性紊乱，视网膜组织缺血缺氧，从而促进大量VEGF产生。VEGF被认为是眼内促新生血管生长因子中的最关键因子，在DR的发生发展中扮演非常重要的角色，参与了DR形成的各个环节[8]。血管的新生包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。抑制VEGF的产生及其受体的过度表达可以延缓DR病变的发生发展[9]，因此可以抑制VEGF表达的药物有望成为糖尿病视网膜病变的有效治疗药物。

虫草素是我国传统中草药中的滋补珍品，是从蛹虫草中提取的一种核苷类抗生素，具有抗肿瘤、抗新生血管、抗白血病、抗菌、免疫调节、清除体内自由基、降血糖、降血脂等多种生物活性和药理作用[10]。目前多用于抗肿瘤和肾病的治疗，据报道虫草素对糖尿病肾病的治疗取得良好的疗效，可通过下调TGF-β的表达抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的发生[11-12]。Yoo等[13]就冬虫夏草水提取物(cordyceps militaris extract，CME)的抗新生血管及抗肿瘤作用做了有益的探讨，结果发现不管在体内还是体外，虫草素均能通过下调基质金属蛋白酶MMP-2的表达，发挥抗新生血管和抗肿瘤的作用，而MMP-2对VEGF、VEGFR2蛋白的表达具有抑制作用。Won等[10]研究也证明了虫草素具有抗炎及抗新生血管的活性。

图2虫草素对高糖下RF/6A细胞迁移的抑制作用(×400)A：NC组；B：HG组；C：HG+10μg/mL组；D：HG+50μg/mL组；E：HG+100μg/mL组；F：虫草素对RF/6A细胞迁移抑制作用的条形图(aP<0.05vsNC组；cP<0.05vsHG组)。

图3虫草素对高糖下RF/6A细胞管腔形成的抑制作用(×200)A：NC组；B：HG组；C：HG+10μg/mL组；D：HG+50μg/mL组；E：HG+100μg/mL组；F：虫草素对RF/6A细胞迁移抑制作用的条形图(aP<0.05vsNC组；cP<0.05vsHG组)。

本实验依据相关的文献[11,14-15]及预实验的结果，选定了10、50、100μg/mL共3个质量浓度进行实验，以证明虫草素对体外高糖条件下RF/6A细胞血管新生的作用，并探讨其可能的作用机制。结果发现，高糖条件下，不同浓度的虫草素对RF/6A增殖、迁移、管腔形成均有抑制作用。而新生血管的生成包括细胞增殖、细胞迁移和管腔形成等过程，因此虫草素在体外高糖环境下能够抑制血管的新生。VEGF有两种主要受体(VEGFR1和VEGFR2)，其中VEGFR2存在于血管和淋巴管内皮等处。在生理和病理血管新生中，VEGFR2均是主要的信号转导蛋白，通过自身磷酸化触发下游一系列信号通路，促进血管的发生。为进一步探讨虫草素抑制高糖下RF/6A 细胞血管新生的作用机制，本实验采用Western-Blot的方法检测VEGF和VEGFR2蛋白的表达。与正常组比较，高糖组中的VEGF和VEGFR2蛋白表达明显增多，高糖促进了VEGF和VEGFR2蛋白的表达。不同浓度梯度的虫草素均能下调高糖培养的血管内皮细胞VEGF和VEGFR2的表达，且随着作用浓度的增加，虫草素抑制血管内皮细胞VEGF和VEGFR2蛋白表达的作用增强。提示虫草素可能通过改变VEGF和VEGFR2的表达，从而影响血管新生。因此虫草素抑制细胞VEGF和VEGFR2表达可能是其抑制血管新生作用的一个重要机制。

图4各组RF/6A细胞中VEGF和VEGFR2蛋白的表达A：各组RF/6A细胞中VEGF和VEGFR2蛋白电泳条带；B：VEGF表达条形图；C：VEGFR2表达条形图(aP<0.05vsNC组；cP<0.05vsHG组)。

本实验首次将虫草素运用于眼科研究，从体外实验着手初步探讨了虫草素对体外高糖培养的RF/6A细胞增殖、迁移、管腔形成和VEGF、VEGFR2蛋白表达的影响，为虫草素用于体内实验提供了一定参考，为临床治疗DR提供了新的思路。但虫草素如何下调VEGF和VEGFR2蛋白表达的机制需要进一步研究证实。

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Anti-angiogenic mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cell line cultured in high glucose condition

Xiao-Li Zhu*, Xiao-Feng Sun*, Ming-Ying Lai

s:Shenzhen Knowledge Innovation Program of Basic Research (No.JCYJ20130402145545766); Shenzhen Science and Technology Plan Project (No.201202144)

Ming-Ying Lai. Shenzhen Eye Hospital Affiliated to Jinan University, Shenzhen Key Laboratory of Ophthalmology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China. laimydoc@163.com

2016-01-27Accepted：2016-06-14

•AIM: To investigate the angiogenesis effect and protective mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial (RF/6A) cell line cultured in high glucose condition.

Cordycepin; high glucose condition; rhesus macaque choroid-retinal endothelial (RF/6A) cell line; vascular endothelial growth factor; neovascularization

深圳市知识创新计划基础研究项目(No.JCYJ20130402145545766)；深圳市科技计划项目(No.201202144)

(518000)中国广东省深圳市，深圳市眼科医院 暨南大学附属深圳市眼科医院 深圳眼科学重点实验室

朱小丽，女，副主任护师，护士长，研究方向：眼科护理；孙小凤，女，毕业于暨南大学，硕士，主治医师，研究方向：眼底病。

赖铭莹，毕业于中山大学眼科中心，博士，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：青光眼、眼底病.laimydoc@163.com

2016-01-27

2016-06-14

Zhu XL, Sun XF, Lai MY.Anti-angiogenic mechanism of cordycepin on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cell line cultured in high glucose condition.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1237-1241

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.08

注：*朱小丽和孙小凤对本文贡献一致。

Shenzhen Eye Hospital Affiliated to Jinan University, Shenzhen Key Laboratory of Ophthalmology, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Co-first authors:*:Xiao-Li Zhu and Xiao-Feng Sun.