银杏内酯B对高糖诱导人晶状体上皮细胞凋亡的影响

王彦红，兰天野，陈　婷，刘　平，林丽丽



·实验研究·

银杏内酯B对高糖诱导人晶状体上皮细胞凋亡的影响

王彦红，兰天野，陈婷，刘平，林丽丽

•METHODS: The high glucose-induced HLEC model was established. Different concentrations of ginkgolide B were intervened. Cell viability was assayed by MTT assay, morphology of cell apoptosis was observed by hochest33258 staining. Cell ultrastructural changes were detected by transmission electron microscopy. Expressions of apoptosis-related factors caspses-3 and caspase-9 were tested by colorimetric detection.

•RESULTS: High glucose inhibited the activity of HLECs, induced apoptosis reaction of HLECs, caused high expression of apoptosis factors in cells; while ginkgolide B inhibited the decrease of cell viability induced by high glucose, decreased the HLEC apoptosis and reduced the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9.

•CONCLUSION: Ginkgolide B may inhibit the expression of caspses-3 and caspase-9 then effectively inhibited high glucose-induced apoptosis in HLECs.

目的：探讨银杏内酯B对高糖诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)凋亡的影响。

方法：建立高糖诱导的HLECs模型，用不同浓度的银杏内酯B干预，MTT比色法检测细胞存活率，Hochest33258染色观察凋亡细胞形态，透射电镜观察细胞内超微结构变化，比色法检测凋亡相关因子Caspase-3及Caspase-9的表达。

结果：高浓度葡萄糖可抑制HLECs活性，诱导HLECs发生凋亡，引起细胞内Caspase-3及Caspase-9表达水平升高；银杏内酯B能明显抑制高糖诱导的HLECs活力的下降，降低细胞凋亡率，减少高糖所致HLECs细胞内Caspase-3及Caspase-9的表达。

结论：银杏内酯B可能通过抑制Caspase-3及Caspase-9的表达而有效抑制了高糖诱导的HLECs凋亡。

银杏内酯B；高糖；晶状体上皮细胞；凋亡

引用：王彦红，兰天野，陈婷，等.银杏内酯B对高糖诱导人晶状体上皮细胞凋亡的影响.国际眼科杂志2016;16(7):1242-1244

0引言

糖尿病是一种因体内胰岛素分泌不足或相对缺乏而导致的一系列临床综合征。糖尿病慢性并发症严重威胁人类健康，其中糖尿病性白内障已成为糖尿病并发症中仅次于视网膜病变的第二大眼病[1]。银杏内酯B(ginkgolide B，GB)为银杏叶中的主要成分，是血小板活化因子和钙通道拮抗剂，具有减轻栓塞及缺血所致的各类异常炎性反应的作用，已应用于治疗心血管系统疾病[2-3]。有研究证实，银杏内酯B可对实验性糖尿病大鼠血管系统发挥保护作用[4]，在眼部，银杏内酯B通过抑制视网膜神经节细胞凋亡促进其轴突生长，从而发挥视神经保护作用[5]，但是对传代培养的HLECs影响的研究很少。本研究通过体外培养HLECs，观察银杏内酯B干预后高葡萄糖浓度下HLECs形态及生长情况的变化，探讨银杏内酯B对HLECs凋亡的抑制作用，为糖尿病性白内障的发病机制及防治提供新的途径。

1材料和方法

1.1材料HLECs(ATCC公司)，银杏内酯B(北京索来宝科技有限公司，纯度>99%)，胎牛血清、DMEM培养基(美国Hyclone公司)，MTT试剂盒(上海伯奥生物制品公司)，Hoechst33258试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1 HLECs培养HLECs培养在含链霉素100μg/mL、青霉素100U/mL的DMEM培养基中，胎牛血清浓度为10%，培养箱内CO2体积分数为5%，温度为37℃，细胞接种密度为5×105/mL，维持细胞生长密度为80%～90%，每3～5d传代1次。

1.2.2实验分组实验共分4组：(1)阴性对照组：以正常培养液培养。(2)氧化损伤组：30mmol/L葡萄糖溶液作用12h。(3)银杏内酯B组：加入银杏内酯B作用24h之后，加入30mmol/L葡萄糖溶液作用12h，依银杏内酯B浓度不同分为两个亚组(1mol/L和10mol/L)。

1.2.3 MTT比色法检测各组HLECs细胞活力细胞接种于96孔板中，接种密度为1×105/mL，培养24h后，向各孔细胞中加入20μL MTT(5g/L)，温育4h，去除培养液后加入200μL DMSO溶液，室温下振荡10min后，用酶标仪测定各孔570nm的光密度值，细胞活力=(各组细胞光密度值/正常组细胞光密度值)×100%。

1.2.4透射电子显微镜观察各组HLECs超微结构的变化4℃下用2.5%戊二醛溶液固定各组细胞24h，1%锇酸后固定，PBS洗涤细胞2次，醋酸铀快染，乙醇-丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片机切片后用柠檬酸、醋酸铀双重染色，观察细胞内结构改变。

1.2.5 Hochest33258染色观察HLECs凋亡细胞形态细胞经相应处理后用PBS洗涤细胞2次，在150μL的Binding Buffer中加入2μL Hoechst染液，避光、室温反应5min后置于荧光显微镜下观察，正常细胞核表现为暗蓝色，凋亡细胞的细胞核为亮蓝色。

1.2.6比色法检测各组HLECs中Caspase-3和Caspase-9的活性收集细胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min离心10min，收集细胞并用PBS冲洗2次，每份样品加30μL细胞裂解液，冰上孵育20min，10 000r/min离心10min，进行Caspase-3和Caspase-9活性检测，检测方法按Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒进行。Caspase活性=OD405nm/OD595nm。

2结果

2.1银杏内酯B对各组HLECs活性的影响阴性对照组细胞活性为98.67%±3.44%，葡萄糖干预后细胞活性下降到32.67%±3.63%，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(F=1.56，P<0.01)。用不同浓度银杏内酯B处理后，HLECs活性分别提高到48.67%±3.32%和59.00%±3.57%，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义(F=3.10、1.72，P<0.05，图1)。

2.2各组HLECs超微结构的变化阴性对照组HLECs形态完整，核膜连续，核仁呈椭圆形(图2A)；30mmol/L葡萄糖诱导的HLECs胞膜不清晰，细胞明显膨胀，胞内线粒体出现空泡及变性，细胞核亦膨胀明显(图2B)；不同浓度的银杏内酯B处理后，HLECs超微结构损害程度依次减轻，逐渐可看到细胞内细胞器结构，尤其是高剂量组作用明显(图2C～D)。

图1MTT法检测银杏内酯B对高糖诱导的HLECs活力的影响aP<0.05，bP<0.01vs氧化损伤组。

2.3银杏内酯B对高糖诱导HLECs凋亡的影响Hoechst33258核染色法显示，阴性对照组未见明显凋亡染色的细胞核；氧化损伤组凋亡细胞明显增多，细胞核荧光较强，呈致密浓染；给予不同浓度的银杏内酯B作用后凋亡细胞减少，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义(F=1.25、8.71，P<0.05)，且细胞核形态改善，荧光强度逐渐减弱(图3、4)。

2.4银杏内酯B对高糖诱导HLECs凋亡相关蛋白表达的影响由表1可知，HLECs经葡萄糖处理后，Caspase-3和Caspase-9的表达明显增加，与阴性对照组比较差异具有显著统计学意义(F=2.17、1.66，P<0.01)。给予不同浓度银杏内酯B处理后，Caspase-3和Caspase-9表达量下降，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义(F=2.54、1.73，P<0.05)。

3讨论

抗氧化剂银杏内酯B是一种天然抗氧化剂，在保护心肌、抗休克、改善脑缺血-再灌注、急性胰腺炎的救治方面发挥重要作用。国内外大量研究已经证实银杏内酯B能减轻细胞凋亡与损伤，清除自由基、抗脂质过氧化，从而发挥对组织的保护作用[6-7]。李爽乐等[8]曾经报道过银杏叶提取物通过增加Bcl-2蛋白表达，减少Bcl-2/Bax表达，阻止氧化损伤所致的SD大鼠晶状体上皮细胞凋亡。但是关于银杏内酯B对HLECs氧化损伤的保护作用鲜有报道。高糖是糖尿病性白内障患者晶状体混浊的主要诱发因素。研究证实，高糖环境促使机体处于氧化应激状态，机体的抗氧化防御系统被严重削弱，晶状体受到氧化剂的攻击，致使晶状体蛋白质发生氧化损伤，最终发生晶状体混浊[9]。本实验中，细胞活力检测结果显示高糖处理的HLECs活力明显降低，凋亡染色证实高糖明显增加了HLECs凋亡数量；电镜观察细胞超微结构显示，经高糖处理的细胞，其结构损伤明显，但是经过银杏内酯B预处理的细胞，其活力得到不同程度的改善，凋亡细胞数量减少，细胞形态逐渐改善，说明该药物在一定程度上能够抑制高糖诱导的细胞损伤，而且对细胞的保护作用呈剂量依赖性。

Caspase-3和Caspase-9是细胞凋亡通路的重要启动者和参与者[10]。我们的研究结果显示，30mmol/L葡萄糖作用HLECs后，两种凋亡因子的表达量均明显上升，而予以银杏内酯B处理后，Caspase-3和Caspase-9表达减少，其下降趋势与银杏内酯B的剂量呈正相关，表明银杏内酯B确实能抑制HLECs的凋亡，并且抗凋亡作用主要是通过抑制Caspase-3和Caspase-9激活实现的。

图2透射电镜观察各组HLECs超微结构改变A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：1mol/L银杏内酯B组；D：10mol/L银杏内酯B组。

图3银杏内酯B对氧化损伤致HLECs凋亡的抑制作用(×200)A：阴性对照组；B：氧化损伤组；C：1mol/L银杏内酯B组；D：10mol/L银杏内酯B组。

图4银杏内酯B对氧化损伤致HLECs凋亡抑制率的影响bP<0.01vs氧化损伤组。

表1　银杏内酯B对高糖致HLECs损伤Caspase-3和Caspase-9活性的影响，U/mL)

注：aP<0.05vs氧化损伤组；bP<0.01vs阴性对照组。

综上所述，银杏内酯B对高糖诱导的HLECs凋亡具有一定的抑制作用，抑制效应与药物浓度有关，从而可能减少HLECs细胞凋亡及由此引起的病理损害。本研究结果提示了银杏内酯B在白内障防治方面的运用潜力，为氧化应激相关晶状体疾病的防治提供新的实验证据。

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4闵志雪,包鹏举,崔凤娟,等.银杏内酯B对实验性糖尿病血管病变的保护作用.医学理论与实践 2012；25(21):2616-2618

5王振宇，莫晓芬，蒋旭花，等.银杏内酯B通过抑制视网膜神经节细胞凋亡促进其轴突生长.生理学报 2012；64(4):417-424

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8李爽乐，罗清礼，李正时，等.银杏叶提取物对H2O2诱导的晶状体上皮细胞Bcl-2和Bax表达的影响.国际眼科杂志 2006；6(4):786-788

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10 Li X, Qi Z, Zhao L,etal. Astaxanthin reduces type 2 diabeticassociated cognitive decline in rats via activation of PI3K/Akt and attenuation of oxidative stress.MolMedRep2016；13(1):973-979

Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis

Yan-Hong Wang, Tian-Ye Lan, Ting Chen, Ping Liu, Li-Li Lin

National Natural Science Foundation of China (No.30973275)

Li-Li Lin. Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. liuping3958@163.com

2016-03-09Accepted：2016-06-03

•AIM: To study the effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell (HLEC) apoptosis.

ginkgolide B; high glucose; lens epithelial cells; apoptosis

国家自然科学基金(No.30973275)

(150001)中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第一医院眼科

王彦红，护师，研究方向：白内障。

林丽丽，硕士，主管护师，研究方向：白内障.liuping3958@163.com

2016-03-09

2016-06-03

Wang YH, Lan TY, Chen T,etal. Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1242-1244

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.09

Departmentof Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China