脯氨酸羟化酶PHD2在鼻咽癌患者中的表达及临床意义

向元俤，张碧波，吴 娟，姚 琦，李春丽，王陈荣

（武汉市第一医院，1.耳鼻咽喉科，2.皮肤科，湖北武汉430022）

脯氨酸羟化酶PHD2在鼻咽癌患者中的表达及临床意义

向元俤1，张碧波1，吴 娟2，姚 琦1，李春丽1，王陈荣1

（武汉市第一医院，1.耳鼻咽喉科，2.皮肤科，湖北武汉430022）

目的 研究脯氨酸羟化酶2（prolyl hydroxylase2，PHD2）在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达差异及其临床意义。方法 运用免疫组化染色及评分、荧光定量PCR方法检测56例鼻咽癌组织及56例癌旁组织中PHD2的表达差异，分析PHD2表达水平与鼻咽癌患者临床病理指标之间的关系。结果 免疫组化结果显示，在56例鼻咽癌组织中PHD2阳性率19.6%（11/56），其中“-”为45例，“+”为6例，“++”3例，“+++”2例；56例癌旁组织中PHD2阳性率为69.6%（39/ 56），“-”为17例，“+”为8例，“++”10例，“+++”21例，鼻咽癌组织的PHD2表达水平显著低于癌组织（P＜0.05）；荧光定量PCR检测结果显示，在鼻咽癌组织中PHD2 mRNA的表达水平低于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PHD2的表达与患者年龄、性别、分化程度无相关性（P＞0.05），而与鼻咽癌的临床分期、T分期、淋巴结转移具有相关性（P＜0.05）。结论 PHD2在鼻咽癌的发生发展中可能起到抑制癌症进展的作用，患者的PHD2表达水平可能与其分期及转移有关。

PHD2； 鼻咽癌； 免疫组化； 表达水平； 临床意义

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种起源于鼻咽部的非淋巴细胞恶性肿瘤［1］，我国南方地区是全球鼻咽癌高发地区，男性发病率为0.02%～0.22%，女性发病率为0.08% ～0.10%（8～10）/ 10万［2］。其具体病因尚不明确，既往研究表明其可能与原癌基因激活、EB病毒感染、抑癌基因的失活、环境因素改变等相关。目前，鼻咽癌的治疗主要以手术、放射治疗为主，治疗的结果不仅与病理类型、病理分级和临床分期密切相关，还与患者自身状态及相关分子的表达相关。尽管NPC的发病机制在基因水平、环境因素等方面得到了深入的认识，化疗、放疗等为主的综合治疗也有了长足的发展，但NPC的预后却没有得到明显的改善。因此，继续寻找新的生物标志物及治疗手段显得尤为重要［3］。在多种恶性肿瘤发生过程中，缺氧诱导子（hypoxia inducible factor，HIF）调节的肿瘤代谢途径转化起着重要作用，越来越多的证据表明，HIF将成为肿瘤治疗的靶点之一，降低HIF的蛋白水平成为一代难点及亮点。HIF蛋白的降解关键步骤是脯氨酸残基的羟化，催化这一过程的关键限速酶是脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）［4］。PHD包括PHD1、PHD2、PHD3三种亚型，均含有α、β两种亚基，现已证实，PHD2是HIF最重要的调控因子，PHD2在肿瘤细胞的增殖、侵袭等方面扮演了重要角色［5］。目前关于 PHD2在鼻咽癌中的研究尚不多见，因此，本文旨在PHD2在鼻咽癌组织和癌旁组织间的表达差异，为临床相关研究及防治提供思路。

材料与方法

1 临床研究对象

收取2008年5月至2013年9月我院肿瘤科及耳鼻喉科患者的鼻咽癌组织标本，所有患者均经过影像学、组织活检确诊。分别取鼻咽癌组织及正常癌旁组织（距离癌组织2.5cm以上，且镜下未见病理异常）56例，年龄为33～78岁，平均年龄59±4.3岁。其中临床分期I～II期41例，III～IV期15例；T1+T2期38例，T3+T4期18例；男性患者48例，女性患者8例；无颈部淋巴结转移33例，有颈部淋巴结转移23例；高分化19例，中低分化37例。所有病人均签写知情同意书。将所有标本取材后，根据实验处理不同，立即分为两个部分，其中一部分置于4%多聚甲醛中固定保存，后期进行免疫组化实验，另一部分则立即在显微镜下进行组织分离，将其分为癌组织和癌旁组织，冻存于液氮中，后期采用荧光定量PCR验证PHD2的表达情况。

2 免疫组化

①各组标本4%多聚甲醛固定最少24小时后，送至我院病理科进行石蜡包埋、脱水、切片，切片厚度约为2.5μm。切片标本置于载玻片后，在75℃烤箱里烤3小时，然后立即置于梯度二甲苯溶液和梯度乙醇溶液中进行切片脱蜡，放置待用。②使用碧云天公司抗原修复液进行修复，对已脱蜡的病理切片进行HE染色和 PHD2免疫组化染色。染色步骤为：3%H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡约5 min（至少两次）；5%～10% 正常山羊血清（PBS稀释）封闭，置于室温孵育约10min，倾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育4小时或4℃过夜；PBS冲洗，5min，3次；滴加适量生物素标记的二抗工作液，37℃孵育约10～30min；PBS冲洗，5min，3次；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育约10～30min；PBS冲洗，5min，3次；显色剂显色15min（DAB）；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。PHD2一抗购自Sigma公司，阳性对照采用Hela细胞，阴性对照使用磷酸盐缓冲液（PBS）替代一抗。染色结束后，置于显微镜下拍照分析并统计各组之间PHD2表达差异。

3 组织RNA提取及荧光定量PCR验证

3.1 样品RNA的抽提 ①取液氮中冻存的组织，立即置于液氮中碾磨；②两相分离：每1mL的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖。手动或涡旋剧烈振荡管体最少15s后，室温孵育5min。4℃下12000rpm离心15min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%；③将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中，然后加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后室温孵育15min，4℃12000rpm离心15min。此时可见胶状沉淀块；④RNA清洗移去上清液，分别连续使用1mL的75%乙醇（75%乙醇用 DEPC水配制）、无水乙醇清洗RNA沉淀，混匀后，4℃下7000rpm离心5min；⑤小心吸去大部分乙醇溶液后，使RNA沉淀在室温空气中干燥5min，然后使用无RNA酶的水40μL用枪反复吹打，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

3.2 测定组织RNA浓度 本研究所获取的RNA其A260/A280比值皆在1.8～2.3区间，浓度在100ng/mL～2000ng/μL之间，A230/A280比值均在2.0以上，说明标本提取过程比较标准，所得样品纯度较好；

3.3 RT-PCR及Real time PCR RT-PCR采用TAKARA逆转录试剂盒20μL体系，其中RNA模板为1μg，Oligo dT引物和随机引物各1μL，PCR buffer为 4μL（包含镁离子、dNTPs、甘油等），逆转录酶为1μL，其余用DEPC水补足，RT-PCR反应条件为：37℃ 15min，85℃ 5秒，4℃ ∞；Real time PCR：本实验采用20μL反应体系，其中模板为100μg，PHD2上下游引物各使用1μL，TAKARA SYBR GREEN为10μL，其余用DEPC水补足；Real time PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30秒+57℃30秒+72℃30秒共计40个循环，72℃3min，4℃∞，并在退火时采集荧光值。PHD2引物序列为：上游引物：AAGCCCAGTTTGCTGACATTG，下游引物：TAGCTCG TGCTCTCTCATCTG，产物长度：150bp；内参基因为GAPDH，其引物序列为：上游引物：AATGGGCAGCCG TTAGGAAA，下游引物：GCGCCCAATACG ACCAAATC，产物长度：168bp。

4 免疫组化结果判定标准

本研究采取双盲法判定免疫组化实验结果，染色结束后，在光学显微镜高倍镜下（400倍）观察切片，设计为每个标本切片4张，每张切片随机选择8个视野机型比较。PHD2免疫组化染色的最终得分以阳性细胞百分率及染色强度得分两项得分之后进行计算，其中细胞染色强度得分评判标准为：无着色0分，弱着色1分（浅黄色），中等着色2分（棕黄色），强着色3分（黄褐色）。阳性细胞百分率及得分计算方法为：阳性细胞≤5%记为0分，阳性细胞≤6%～25%记为1分，阳性细胞≤26%～50%记为2分，阳性细胞＞50%记为3分。将两项得分相加后进行组化结果着色强度判定，判定标准为：0分阴性（记为-），1～2分为弱阳性（记为+），3～4分为中等阳性（记为++），5～6分为强阳性（记为+++）。

5 统计学分析

本研究采用SPSS15.0统计学软件进行统计，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 免疫组化检测及PHD2在癌旁组织中和鼻咽癌组织的表达差异情况

在高倍显微镜下，可以看到，在鼻咽癌组织和癌旁组织中，PHD2在细胞核和细胞质中都有表达，呈均匀分布，各切片免疫组化染色分别呈黄色、棕黄色、黄褐色（图1）。在56例鼻咽癌组织中，PHD2的蛋白表达水平为“-”45例，“+”6例，“++”3例，“+++”2例，PHD2蛋白表达阳性率为19.6%（11/ 56）；56例癌旁组织中，PHD2蛋白表达水平为“-”17例，“+”8例，“++”10例，“+++”21例，PHD2蛋白表达阳性率为69.6%（39/56）。经过统计分析，鼻咽癌组织的PHD2表达水平显著低于癌组织，差异具有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

表1 PHD2在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达分布情况

2 Real time PCR检测PHD2 m RNA在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达差异

TRIZOL法提取56例鼻咽癌旁组织和56例癌组织的RNA，经逆转录之后，Real time PCR检测PHD2在鼻咽癌癌旁组织和癌组织中的表达差异情况（见图2）。结果提示PHD2在鼻咽癌癌旁组织中的表达显著高于癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 PHD2蛋白表达水平与患者的临床病理特征关系

分析免疫组化染色结果与鼻咽癌患者临床资料之间的关系，发现PHD2的蛋白表达水平差异与性别、年龄、分化程度无相关性（P＞0.05），而与临床分期、T分期、淋巴结转移具有显著相关性（P＜0.05）。表现为PHD2蛋白表达水平越低的患者，其恶性程度越高。见表2。

表2 PHD2蛋白表达与患者临床病理特征的关系

讨 论

肿瘤细胞和正常细胞起源相同，却具有完全不同的生物性状，其发病率具有越来越高的趋势，肿瘤的发病机制以及应对措施也得到了越来越广泛的关注。鼻咽癌的发生、侵袭、转移等一系列事件的演进，是由众多癌基因、抑癌基因及环境因素共同作用的复杂过程。癌基因的过表达或抑癌基因的低表达在肿瘤发生发展的整个过程均发挥作用［6］。我国鼻咽癌在南方高发，死亡率较高，因此，寻找鼻咽癌进程背后的的相关基因表达变化成为国内外研究的热点问题。脯氨酸羟化酶2（PHD2）属于 Fe2+、2-酮戊二酸依赖双加氧家族，在缺氧时被诱导，是缺氧诱导因子Hif-1α降解的主要调节因子，在常氧的条件下，PHD2将Hif-1α的2个脯氨酸残基羟基化从而介导其蛋白酶消化［7］。PHD2在全身各组织都具有广泛表达，主要位于细胞核中，但其具有跨核膜能力，因此，在细胞核和细胞质中均能看到表达。既往研究表明，PHD2的结构域上有缺氧反应元件，且PHD2的表达是受缺氧因素控制，因此，PHD2被认为介导了肿瘤血管形成、缺氧存活及凋亡［8］，和肿瘤微环境的形成密切相关。鼻咽癌作为典型的恶性肿瘤，其癌细胞在缺氧环境下的存活及代谢途径转变，被认为介导了自身存活和演进［9-10］，然而，关于PHD2和鼻咽癌的相关性及具体机制研究却未见诸报道，本研究通过收取本院住院患者组织，统计PHD2在鼻咽癌癌旁组织和癌组织的表达差异。

我们在本研究中采用了免疫组化及评分、real time PCR的方法观察PHD2蛋白在鼻咽癌癌旁组织及癌组织中的表达差异情况。免疫组化结果表明，PHD2蛋白在鼻咽癌癌旁组织和癌组织中均有表达，而且均分布于细胞核和细胞质中。通过细胞染色强度评分和阳性细胞百分率两项统计，我们发现PHD2在鼻咽癌癌旁组织中高表达，然而在癌组织中表达水平较低，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示PHD2的表达水平可能和鼻咽癌这一疾病具有相关性。随后我们采用了real time PCR检测 PHD2在鼻咽癌癌旁组织和癌组织中的表达水平差异，结果表明：鼻咽癌癌旁组织的PHD2在mRNA水平显著高于癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过进一步分析PHD2的表达水平与患者临床病理指标的关系，我们发现，PHD2的表达水平与年龄、性别、分化程度并不具有相关性（P＞0.05），而与肿瘤的临床分期、T分期、淋巴结转移情况具有相关性（P＜0.05），表现为PHD2蛋白表达水平越低的患者，其恶性程度越高，预后越差，这与部分研究者的前期研究成果一致。既往研究提示，PHD2蛋白表达与肝癌的侵袭转移，尤其是肝门静脉浸润过程中，可能起到了关键作用，并与结肠癌的侵袭转移密切相关，我们的研究发现，随着鼻咽癌分期的提高、淋巴结转移的增多，PHD2蛋白表达水平也相应降低，具有负相关，提示PHD2可能与鼻咽癌的侵袭、转移过程关系密切，但其影响方式及具体机制尚需大量基础实验的验证。

鼻咽癌的肿瘤细胞处于肿瘤炎症微环境中，主要发生机制为肿瘤血管结构及组织分布异常，肿瘤微环境会造成缺氧的特征［11］，长期缺氧会导致肿瘤细胞出现适应性改变，出现无氧糖酵解的增强和炎症性蛋白质的表达增加，最终导致肿瘤细胞出现耐药性增加、对辐射的敏感性下降、侵袭及转移能力增加等改变，因此，当前关于肿瘤缺氧的治疗相关靶点研究已成热门。PHD2作为脯氨酸羟化酶中的一大亚型，在缺氧环境关键因子Hif-1α的存留中起到关键作用，介导了Hif-1α的降解，从而可以调控肿瘤细胞的分化、转移、肿瘤血管分布、增殖等诸多方面，目前已成为潜在的治疗靶点［12-13］。

综上所述，我们认为PHD2可能是鼻咽癌细胞在肿瘤微环境中介导缺氧存活的关键蛋白，鼻咽癌组织中的PHD2表达水平可能与远期转移等不良预后具有负相关性。因此，PHD2可能作为鼻咽癌判断预后的敏感生物标志物，上调PHD2的表达可能会成为抑制鼻咽癌细胞的存活、药物耐受、放疗耐受以及侵袭转移等方面的新思路。

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（李 凌编辑）

Expression and Clinical Significance of PHD2 in Nasopharyngeal Carcinoma

XIANG Yuan-di，ZHANG Bi-bo，WU Juan，YAO Qi，LIChun-li，WANG Chen-rong
（Department of Otolaryngology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430022，China）

Objective To explore the expression of prolyl hydroxylase 2（PHD2）and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.M ethods Immunohistochemistry and Real time PCR were used to detect PHD2 expression level of 56 cases of nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues，and to analysis the relationship between PHD2 expression and clinic pathological features of nasopharyngeal carcinoma. Results In 56 cases of nasopharyngeal carcinoma，the positive rate in carcinoma was 19.6%（11/56），“-”45 cases，“+”6 cases，“++”3 cases，“++++”2 cases；and the positive rate in adjacent tissueswas 69.6%（39/56）。Real time PCR showed PHD2 expression level of nasopharyngeal carcinoma was significantly lower than that in adjacent tissues（P＜0.05）.CCR1 expression had no correlation with age，sex and degree of differentiation（P＞0.05，but it correlated with clinical stage，T stage，development of nasopharyngeal carcinoma（P＜0.05）.Conclusion PHD2 is negatively expressed in themajority of NPC，and its expression levelmay be related to the patient′s prognosis.

PHD2； Nasopharyngeal carcinoma； Immunohistochemistry； Expression；Clinical significance

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.06.008

2015-11-03；

2016-04-22

向元俤（1980—），男，硕士，主治医师，研究方向：头颈肿瘤的基础与临床。Email：doctorxiangwuhan@163.com