响应面法优化荞麦壳总黄酮超声辅助萃取工艺

张岚，于婷婷，孙婉玲，王丹，代伟长

（1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013；2.吉林省中医药管理局二级实验室，吉林吉林132013；3.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

响应面法优化荞麦壳总黄酮超声辅助萃取工艺

张岚1，2，于婷婷1，孙婉玲1，王丹1，2，代伟长3

（1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013；2.吉林省中医药管理局二级实验室，吉林吉林132013；3.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

主要研究超声波辅助萃取荞麦壳黄酮的影响因素并采用响应面法优化超声波辅助萃取荞麦壳黄酮类化合物。通过Placket-Burman试验考察料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度、提取次数对黄酮提取率的影响，影响最为显著的3个因素进行最陡爬坡试验，确定中心点；Box-Behnken设计得到最优超声辅助萃取荞麦壳黄酮提取条件。荞麦壳黄酮最佳提取工艺为：料液比1∶49.63（g/mL），提取时间60.53min，提取温度64.70℃，黄酮得率1.58%。考虑到实际可操作性将实际组合定为：料液比1∶50（g/mL），提取时间60min，提取温度65℃。验证在条件下实际黄酮得率为1.581%。

荞麦壳；总黄酮；响应面；超声波

我国荞麦种植面积及产量均较高，资源丰富［1］。荞麦壳重量约占荞麦总重的三分之一，在我国，荞麦壳几乎得不到有价值的利用，一部分制成荞麦枕头，剩余则作为基肥或者焚烧，因此造成很大浪费，不符合可持续发展的价值观。近年来随着科技发展及科研的深入，人们发现荞麦壳富含黄酮类物质，赵玉平等［2］发现荞麦壳中总黄酮含量为1.67%，郭玉蓉等［3］研究发现苦荞麦壳黄酮得率为1.7%。因此以荞麦壳作为原料提取黄酮类化合物有好的开发利用价值。

黄酮类化合物是重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类此生代谢产物［4］。而目前一些相关研究证实，荞麦黄酮具有多种药理活性如清除自由基、调节血管活性物质，特别是对糖尿病［5-8］、高血脂症［9-11］和心血管病［12-15］等具有良好的防治作用。除了上述关于荞麦黄酮的研究，目前应用于临床的荞麦黄酮药物也很多，例如，复方荞麦黄酮胶囊（片剂）用于心脑血管病、荞麦黄酮口腔喷雾剂用于心绞痛的预防和治疗、复方荞麦黄酮喷雾剂用于脱发症的治疗等［16］。

本文采用了近年来在提取工艺上运用比较广泛的超声波辅助萃取并结合响应面法优化荞麦壳中的总黄酮，确定最佳提取工艺参数。

1　材料与方法

1.1材料

吉荞1号荞麦壳：吉林农业大学食品科学与工程学院提供。

1.2试剂及配置方法

芦丁标准品（纯度≥98%）：南宁庞博生物工程有限公司；95%乙醇、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.3仪器与设备

KQ-100DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；722型可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SHB-111A型循环水式多用真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；AF-20A型密封型摇摆式粉碎机：温岭市奥力中药机械有限公司。

1.4方法

1.4.1荞麦壳黄酮的提取

将荞麦壳除杂后铺在洁净地面上洒水进行回潮处理，放置2 h～3 h后将荞麦壳放入高压锅121℃高压处理20 min，将经高压处理后的荞麦壳取出用微波干燥，将干燥的荞麦壳放入摇摆式粉碎机粉碎过60目筛，粉碎过筛后的荞麦壳密封放置干燥处保存备用。

准确称取上述处理过的荞麦壳1.00 g于100 mL锥形瓶中，按一定料液比加入一定体积分数乙醇溶液，在一定温度、超声功率下提取一定时间，提取液冷却后抽滤，旋转蒸发至干，以95%乙醇定容至100 mL，备用。

1.4.2标准曲线绘制

分别准确吸取芦丁标准溶液0.0、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4 mL于比色管中，补加95%乙醇至1.5 mL，分别向各试管中加入0.25 mL 4%亚硝酸钠溶液，静置6 min，再分别加入0.25 mL 10%硝酸铝溶液，静置反应6 min，最后各加入1.5 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀。在波长510 nm测定其吸光度值并记录读数。以芦丁浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。Y=0.010 6X，R2=0.999 7

1.4.3黄酮得率计算

黄酮得率计算公式如下。

式中：m为1.0 mL样品液中黄酮质量，mg；V为样品液总体积，mL；M为样品质量，g。

1.4.4超声辅助萃取荞麦壳黄酮工艺优化

1.4.4.1Plackett-Burman设计

通过Plackett-Burman设计对可能影响超声辅助萃取黄酮效果的参数，包括提取次数（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）、提取温度（D）、料液比（E）进行主效应分析，选用N=5的PB设计，每因素取高（+1）、低（-1）两水平，以黄酮提取率为指标。PB试验因素水平设计见表1。

表1　PB试验因素水平设计表Table 1PB test factor level design table

1.4.4.2最陡爬坡试验

响应面只有在临近最佳值时才能建立有效的响应面方程，最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域［17］。根据PB试验结果，确定3个因素及爬坡方向，选择合理步长，设计最陡爬坡试验路径。

1.4.4.3Box-Behnken Design（BBD）优化设计

在PB试验和最陡爬坡试验结果的基础，选择料液比（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）为因素，Box-Behnken Design设计方案见表2。

1.5数据分析

每次试验重复3次，采用MINITAB16.0软件进行PB试验及BBD试验设计及数据分析。

表2　BBD设计因子及水平表Table 2BBD design factor and horizontal table

2　结果与分析

2.1Placket-Burman试验结果

PB试验结果见表3、表4，主效应分析图见图1。

表3　Placket-Burman设计实验及结果Table 3Placket-Burman design experiments and results

表4　PB实验分析结果Table 4PB experimental results

图1　主效应图Fig.1The main effect diagram

通过对效应值的计算，同时利用minitab16软件对试验数据进行因子分析t检验得到结果如下：

回归方程为：Y=1.43+0.007 7A-0.017 7B+0.022 8C+ 0.064 2D+0.063 5E

根据表4及主效应图（图1）可知，D、E即提取温度和料液比对荞麦壳黄酮提取率影响显著。A、C、D、E为正效应，即提取次数、提取时间、提取温度及料液比的值越大，荞麦壳黄酮提取率越高，B为负效应，即乙醇体积分数越大荞麦壳黄酮提取率越低，最终确定料液比、提取时间、提取温度为响应面优化的因素。

2.2最陡爬坡试验结果

最陡爬坡试验设计及结果见表5。

表5　爬坡试验设计及结果Table 5Climbing experiments and results

由表5可看出随着液料比的增大，提取时间的增加及提取温度的升高，黄酮得率呈现先逐渐增大再减小的趋势，当料液比为1∶50（g/mL），提取时间为60 min，提取温度60℃时吸光度最大黄酮含量最多即黄酮得率最高，为3因子的最大响应值区域，因此以试验号4的各因素水平为中心点值设计下一步响应面试验。

2.3BBD试验结果

以料液比1∶50（g/mL），提取时间为60 min，提取温度为60℃为中心点进行响应面分析，BBD设计及结果见表6，回归分析结果见表7。

所得回归方程为：

由表7可知该二次模型多元相关性系数R2= 0.933 6，表明仅有6.64%的不能由此模型解释，回归模型P值（Prob＞F）=0.018表明该模型显著，X1、X3、X12、X22、X1X3均对荞麦壳黄酮提取率有显著影响（P＜0.05）。

根据上述拟合方程得到料液比与提取时间交互作用对荞麦壳黄酮得率的等高线及3D曲面图，见图2。

表6　BBD设计及结果Table 6BBD design and results

表7　BBD设计回归分析Table 7BBD design regression analysis

图2　料液比及提取时间对荞麦壳黄酮得率的影响等高线及3D曲面图Fig.2Influence of 3D surface contour and solid-liquid ratio and extraction time on the yield of buckwheat flavonoids

由图2可看出当料液比从1∶40（g/mL）增大至1∶60（g/mL），提取时间由55 min增大至65 min的过程中黄酮提取率呈现先增大再减小的趋势，曲面的顶点即为黄酮提取率最大值。

2.4验证试验

Box-Behnken设计进一步优化得出最佳组合43组，其中最优组合工艺条件为：料液比1∶48.75（g/mL），提取时间60.14 min，提取温度64.74℃，黄酮得率1.58%。考虑到实际可操作性将实际组合定为：料液比1∶50（g/mL），提取时间60 min，提取温度65℃，经过验证试验，该条件下实际黄酮得率为1.581%，与理论最大值接近。说明运用响应面法优化荞麦壳中总黄酮的提取工艺是可靠的。

3　讨论

本试验选择的吉荞1号荞麦壳黄酮得率为1.581%，与其它研究结果略有出入，熊双丽等［18］的研究得出在以乙醇为提取溶剂利用索氏提取方法的条件下苦荞麦壳和甜荞麦壳的黄酮得率相似，都为1.10%左右。而宋小利等［19］采用超声提取，确定最优工艺为乙醇体积分数63.73%，料液比1∶21.77（g/mL），提取温度75℃，提取时间1 h，在上述条件下测得陕北定边县甜荞麦壳中黄酮类化合物的含量为1.03%。朴春红等［20］的研究得出在乙醇体积分数30%，料液比1∶20（g/mL），提取时间10 min，提取3次条件下内蒙古荞麦壳黄酮得率为2.381%。这可能由于不同生长环境及生长条件影响荞麦主要成分的含量，所以黄酮得率有所差别。

在一定提取温度范围内随着提取温度的升高总黄酮得率也随之增加，这可能是由于荞麦壳中总黄酮在乙醇中的溶解度随温度的升高而增加，同时由于温度升高，扩散系数也随之增大，提取剂渗透力也随之增强，使有效成分析出速率增大，这与熊双丽等［18］及宋小利［19］等人研究趋势相同，但当提取温度超过一定值时提取率不再增加，甚至有减少趋势。提取时间也是影响黄酮提取率的因素之一，在一定时间内随着提取时间的增加黄酮提取率会提高，但超过一定时间后，黄酮得率上升变化缓慢，这与熊双丽等［18］及朴春红等［20］的研究趋势相同。乙醇体积分数及料液比影响黄酮提取率，由主效应图（图1）可看出本文中乙醇体积分数为负效应，即随着乙醇体积分数增大，黄酮提取率随之减小，与郭玉蓉等［3］的研究趋势相同，本文乙醇体积分数范围在40%～60%之间。另外在一定料液比内黄酮得率随料液比的增大而增大，但超过一定值后总黄酮得率下降，这与杨芙莲等［21］的研究趋势相同，且临界值都为1∶50，当料液比达到1∶50（g/mL）后黄酮析出达到平衡，料液比再继续增大对黄酮得率影响不大。

4　结论

通过Placket-Burman设计，从5个影响黄酮提取的因素中筛选出3个影响因素：液料比、提取温度、提取时间，利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域，再利用Box-Behnken设计进一步优化得出最佳组合：料液比1∶48.75（g/mL），提取时间60.14 min，提取温度64.74℃，黄酮得率1.58%。考虑到实际可操作性将实际组合定为：料液比1∶50（g/mL），提取时间60 min，提取温度65℃，实际黄酮得率为1.581%与理论最大值接近，说明运用响应面法优化荞麦壳中总黄酮的提取工艺是可靠的。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Buckwheat Shell by Response Surface Method

ZHANG Lan1，2，YU Ting-ting1，SUN Wan-ling1，WANG Dan1，2，DAI Wei-chang3
（1.Department of Public and Health，Jinlin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.Level Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province，Jilin 132013，Jilin，China；3.College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，Jilin，China）

This paper studied on the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull main factors and the response surface method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hulls.Through the Placket-Burman experiment investigation material to liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction time，extraction temperature，extraction times on the extraction rate of flavonoids，and to determine the effect of the three significant factors for the steepest ascent experiment，determine the center point；Box-Behnken design got optimal ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull extraction conditions.The optimized extraction process was that liquid to solid ratio 1∶49.63（g/mL），extraction time 60.53 min，extraction temperature 64.70℃，flavonoid rate 1.58%.Considering the practical operability，the actual combination was determined as the ratio of material to liquid 1∶50（g/mL），extraction time 60 min，extraction temperature 65℃.After the test，under the optimal extraction condition s of buckwheat flavonoids，the actual extraction rate of flavonoids was 1.581%.

buckwheat shell；total flavonoids；response surface；ultrasonic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.012

吉林省科技厅青年科研基金项目“荞麦壳黄酮改善糖基化终产物诱导的氧化应激作用及机制”（20150520133JH）；吉林省教育厅“十三五”科研项目“荞麦壳黄酮改善2型糖尿病糖代谢及肝糖异生信号转导通路调控”

张岚（1980—），女（汉），副教授，博士，研究方向：生物反应器与功能性食品。

2015-12-14