利用茶叶制备γ-氨基丁酸的工艺研究

韩玮，杨芙莲，董文宾，冯丽琴

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021）

利用茶叶制备γ-氨基丁酸的工艺研究

韩玮，杨芙莲，董文宾，冯丽琴

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021）

采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法对富硒茶中γ-氨基丁酸的含量进行测定，利用Intertsil ODS-C18色谱柱，以15mmol/L的乙酸钠，纯乙腈为流动相进行梯度洗脱。以γ-氨基丁酸质量浓度X（mg/mL）对峰面积Y（mAU·min）作回归曲线，得回归方程Y=3 488.4X＋23.525，相关系数为0.996 5。选用真空处理和谷氨酸钠浸渍处理两种方法对茶叶中γ-氨基丁酸进行富集，并对比富集效果。研究表明，在真空处理条件下处理10 h，富硒茶中γ-氨基丁酸的富集效果最好，γ-氨基丁酸含量增至0.875 mg/mL，是对照品的9.5倍。富硒茶在1%谷氨酸钠溶液浸渍12 h后效果最好，γ-氨基丁酸含量为0.624mg/mL，是对照品的6.8倍。

γ-氨基丁酸；高效液相色谱；富集

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种由4个碳原子组成的非蛋白质氨基酸，广泛存在于真核生物和原核生物中。在高等植物中它是在谷氨酰胺脱羧酶催化下由谷氨酸不可逆脱羧而合成［1］。GABA作为人体和哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质，具有极强的生理活性。研究表明，GABA具有降血压、降低胆固醇、增进脑机能、促进睡眠、镇痛安神、促进生长激素分泌、促进酒精代谢、抗癫痫和抗衰老等多种有益的保健功能［2-6］。近年来，GABA已作为新型的食品功能因子［7］，建立高效准确的检测方法尤为重要。有研究对高效液相色谱法（HPLC）、改良纸层析法及Berthelot比色法进行了比较，结果表明HPLC测定GABA的结果准确、灵敏度高、适用范围广［8］。

GABA是一种植物逆境氨基酸［10］。在逆境胁迫下，GABA能起到应激信号的作用，其积累可提高植物的抗逆性［11］。已有研究表明逆境条件如缺氧、冷藏、失水、机械损伤、低pH、Ca2+浓度等都能强烈刺激植物细胞合成富集GABA［1］。

本试验以富硒茶老叶为原料，利用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生高效液相色谱法建立了一种快速简便测定GABA的方法。为了进一步提高茶叶中的γ-氨基丁酸含量，选用了真空处理和谷氨酸钠溶液浸渍处理两种方法对茶叶中的GABA进行富集，确定一种最佳的富集工艺，以期为GABA功能性产品的开发的研究提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1仪器

Agilent LC1200液相色谱仪：美国安捷伦（Agilent）公司；PL5243 PURE LAB Classic超纯水系统：美国Pall-Gelman公司；101-1AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；BS-224型电子天平：德国SARTORIUS公司；HH-2型恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SC-3610型离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C型精密PH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2材料与试剂

茶鲜叶：陕西安康紫阳富硒茶，2015年11月2日茶园修剪茶树后废弃的老叶。

GABA标准品（≥99%）：美国sigma公司；乙腈（色谱纯）：科密欧试剂有限公司；邻苯二甲醛、2-巯基乙醇、无水乙酸钠、冰乙酸、硼酸均为分析纯。

1.3方法

1.3.1GABA标准溶液的配制

准确称取GABA标准品0.050 0 g，用超纯水溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的GABA标准溶液。分别稀释此标准溶液液至0.050、0.080、0.100、0.200、0.400、0.600 mg/mL，备用。

1.3.2样品预处理

1.3.2.1对照样品

首先用微波炉对茶鲜叶进行杀青，时间1min～2min（使用中高档，每50 s翻匀一次茶叶），放入鼓风干燥箱中80℃烘至绝干，粉碎至细度80目，供分析使用。

1.3.2.2厌氧处理试验

将鲜叶晾晒至含水量约70%，用真空干燥箱在真空度0.08 MPa及温度30℃下对其进行厌氧处理4、6、8、10、12、14 h（每个真空条件处理100 g鲜叶），处理完毕后即刻用微波炉杀青1 min～2 min（使用中高档，每50 s翻匀一次茶叶），放入鼓风干燥箱中80℃烘至绝干，粉碎至细度80目，供分析使用。

1.3.2.3谷氨酸钠溶液处理试验

晾晒鲜叶100 g到含水量约70%，分别将茶叶用0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的谷氨酸钠溶液，用其浸泡12 h后用去离子水润洗沥干用以除掉表面残留的谷氨酸钠，然后用微波炉杀青1 min～2 min（使用中高档，隔50 s翻匀一次茶叶），放入鼓风干燥箱中80℃烘至绝干，粉碎过80目筛，供分析使用。

1.3.3γ-氨基丁酸的提取

茶粉5g→加10%冰醋酸溶液10mL与茶粉混匀→加去离子水50 mL→60℃浸提1.5 h→以3 600 r/min转速离心保留清液→滤渣用于重复此操作→合并2次滤液定容至150 mL→放入4℃冰箱保存待用。

1.3.4衍生液的制备

准确称取0.2 mg邻苯二甲醛粉末，用10 mL甲醇溶解完全后，加入pH10.2，浓度0.4 mol/L的硼酸缓冲液40mL和600μL2-巯基乙醇，4℃条件下可存放2d。

1.3.5衍生化反应

取茶叶样品或GABA标准液100 μL于样品瓶中，加入邻苯二甲醛衍生液1 000 μL，涡旋振荡5 s后静置2 min，过0.45 μm微孔滤膜，取20 μL进样。

1.3.6色谱条件

色谱柱：IntertsilODS-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：流动相A为15 mmol/L的乙酸钠，用4%的冰醋酸调pH值至5.90±0.05；流动相B为纯乙腈；流速为1 mL/min；柱温30℃；进样量20 μL；检测波长为332 nm；梯度洗脱程序如表1所示。

表1　梯度洗脱程序表Table 1Gradient elution program list

2　结果与讨论

2.1GABA标准曲线的绘制

按照1.3.1方法配制GABA系列浓度的标准溶液后，根据1.3.5及1.3.6方法依次进行柱前衍生反应及HPLC测定，以峰面积Y（mAU·min）对质量浓度X（mg/ mL）绘制标准曲线。标准曲线如图1所示。

回归方程Y=3 488.4X＋23.525，相关系数为0.9965。由此表明，用该法测GABA质量浓度在0.02 mg/mL～1 mg/mL之间呈现良好的线性关系，可作为GABA的精确定量分析方法。

图1　GABA的标准曲线Fig.1GABA standard curve

2.2γ-氨基丁酸的定性分析

在1.3.6中的色谱分析条件下，利用Intertsil ODSC18柱对已衍生的标样和富硒茶叶样品组分进行了有效地分离。无γ-氨基丁酸的空白衍生液、标准品以及富硒茶样品的色谱图分别见图2、图3、图4。

图2　空白衍生液液相色谱图Fig.2Liquid phase chromatogram of blank derivative liquid

图3　GABA标准液液相色谱图Fig.3Liquid phase chromatogram of the GABA standard

由图2～图4对比可知，γ-氨基丁酸的保留时间为18.4 min左右；富硒茶样品中其它共存氨基酸和杂质对目标物的测定没有干扰。

2.3精密度试验

图4　样品液液相色谱图Fig.4Liquid phase chromatogram of the sample

取0.08 mg/mL的标准品重复进样5次，根据5次测定样品中GABA含量的数据可得峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.845%，质量浓度的相对标准偏差（RSD）为0.432%，表明该色谱系统适用于GABA的含量测定。

2.4真空处理时间对富硒茶中GABA含量的影响

真空处理时间对富硒茶中GABA含量的影响见图5。

图5　真空处理时间对GABA含量的影响Fig.5Effect of vacuum processing time on the GABA content

由图5可知，不同的真空处理时间对富硒茶GABA的富集效果存在差异，保持其它条件一致的情况下，富硒茶中GABA含量随着真空时间的延长先增后减，在真空处理10 h时富硒茶中GABA的富集效果最好，原因可能是由于真空时间过长会影响L-谷氨酸脱羧酶的活性，使其合成受到抑制。富硒茶对照品中GABA含量为0.092 mg/mL，而经过真空处理10 h后富硒茶中GABA含量增至0.875 mg/mL，相比而言，真空处理10 h后富硒茶GABA含量是对照品的9.5倍。

2.5谷氨酸钠浸渍茶鲜叶中GABA含量的影响

谷氨酸钠浸渍茶鲜叶中GABA含量的影响见图6。

由图6可知，不同浓度谷氨酸钠对富硒茶中GABA的富集也存在差异。富硒茶中GABA随着谷氨酸钠浓度的增加先增后减，在1%浓度时富硒茶GABA含量达到在最大。原因可能是谷氨酸钠底物浓度过高会抑制GABA的合成。通过色谱数据分析得1%谷氨酸钠溶液浸泡12 h后，富硒茶含量为0.624 mg/mL，是富硒茶对照品中GABA含量的6.8倍。

图6　谷氨酸钠溶液浓度对GABA含量的影响Fig.6Effect of concentration of the solution of sodium glutamate on GABA content

3　结论

本研究采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法对茶叶中GABA的含量进行测定，具有高效、结果准确、精密度好的特点。选用真空处理和谷氨酸钠溶液浸渍处理两种方法对茶叶中的GABA进行富集，结果表明，真空处理10 h后，茶叶中的GABA富集效果最好，是对照品的9.5倍。该试验以富硒茶废弃老叶为原料，不仅提高了茶叶资源的利用率，还增加了茶叶的附加值，对茶叶的市场价值开发具有重要的意义。这不仅为后期开发茶叶系列的功能性产品提供了有力的理论依据，也为该系列产品中GABA含量测定提供了有效的分析手段。关于GABA更好的富集方法有待进一步研究。

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［2］林智，林钟鸣，尹军峰，等.厌氧处理对茶叶中γ-氨基丁酸含量及其品质的影响［J］.食品科学，2004（2）：35-39

［3］Ki-Bum Park，Suk-Heung oh.Production of yogurt with enhanced levels of gamma aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract［J］.Bioresource Technology，2007，98（8）：1675-1679

［4］毛清黎.茶叶氨基酸的研究进展［J］.氨基酸杂志，1989（4）：16-21

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Study on the Preparation of Gamma Aminobutyric Acid from Tea

HAN Wei，YANG Fu-lian，DONG Wen-bin，FENG Li-qin
（College of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

High performance liquid chromatography method with o-phthaldialdelhyde（OPA）pre-colomn derivatization was used to measure γ-aminobutyric acid content in Se tea.Separation of GABA was carried out on Intertsil ODS-C18 column with the gradient elution of 15 mmol/L sodium acetate and pure acetonitrile.In γaminobutyric acid concentration X（mg/mL）on the peak area Y（mAU·min）draw a regression curve，the regression equation was Y=3 488.4X+23.525，with correlation coefficient of 0.996 5.Tea was processed with vacuum and impregnation with a solution of sodium glutamate to enrich γ-aminobutyric acid，and compared with two enrichment effects.Studies had shown that under vacuum conditions，when Se tea was deal with 10 h，γ-aminobutyric acid enrichment effect was the best，γ-aminobutyric acid content increased to 0.875 mg/mL，which was 9.5 times of the reference.After being impregnated with a solution of 1%sodium glutamate 12 h，γaminobutyric acid enrichment effect was the best，its content was 0.624 mg/mL，which was 6.8 times of the reference.

gamma aminobutyric acid；HPLC；enrichment

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.025

陕西省科技统筹创新工程计划项目（2013KTZB02-01-04）；西安市技术转移促进工程项目（CXY1434-3）；陕西省教育厅产业化培育项目（14JF002）

韩玮（1991—），女（汉），在读研究生，研究方向：食品新材料制备与分析检测技术。

2015-12-15