shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响

张莉 李亚东 陈晨 李凌佳 谢玉燕 刘彤云 寸韡

650000昆明医科大学第一附属医院皮肤科（张莉、李凌佳、谢玉燕、刘彤云）；中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所（李亚东、陈晨、寸韡）

shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响

张莉 李亚东 陈晨 李凌佳 谢玉燕 刘彤云 寸韡

650000昆明医科大学第一附属医院皮肤科（张莉、李凌佳、谢玉燕、刘彤云）；中国医学科学院北京协和医学院 医学生物学研究所（李亚东、陈晨、寸韡）

目的探讨慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物，构建慢病毒载体，转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒，利用慢病毒感染A⁃375细胞系并通过嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染细胞系，实验分为实验组细胞（A375⁃shRNA1和A375⁃shRNA2）、阴性对照组细胞（A375⁃con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT⁃PCR）、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果Semaphorin 5A成功转染A375细胞后，经嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染实验组A375⁃shRNA2细胞系及对照组A375⁃con。反转录PCR及Western印迹检测，干扰后实验组A375⁃shRNA2较对照组A375⁃con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示，A375⁃con与A375细胞生长差异无统计学意义（P＞0.05），A375⁃shRNA2细胞生长明显减慢，与A375和A375⁃con比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。划痕实验结果显示，A375⁃shRNA2划痕处细胞无明显迁移，划痕未得到修复，而A375及A375⁃con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。……