菏泽凤丹牡丹花花青素提取工艺研究

张志超，余辉攀，杨玉琴，肖顺丽，曹丹亮，张宏桂

（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.菏泽金丰鲁德生物科技有限公司，山东菏泽274000）

菏泽凤丹牡丹花花青素提取工艺研究

张志超1，余辉攀1，杨玉琴1，肖顺丽1，曹丹亮2，张宏桂1

（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.菏泽金丰鲁德生物科技有限公司，山东菏泽274000）

目的以花青素含量为指标优选菏泽凤丹牡丹花的最佳提取工艺。方法采用比色法测定其含量，比较乙醇浓度、料液比、提取时间、超声频率等因素对花青素提取率的影响。采用单因素水平考察乙醇体积分数（10%～90%）、料液比（1∶10～1∶40）、提取时间（10～40 min）、超声频率（16～40 kHz）对花青素提取率的影响，以确定花青素最佳提取工艺。结果在单因素考察中，乙醇最佳体积分数范围为70%～90%，最佳料液比范围为1∶15～1∶25，最佳超声频率范围为16～32 kHz，最佳提取时间范围为10～25 min；正交试验极差结果分析表明，所考察的因素中，对凤丹牡丹花花青素提取率的影响程度依次为超声频率＞溶剂体积分数＞液料比＞提取时间；花青素的最佳提取工艺为25倍70%乙醇，24 kHz超声提取12 min；按优化后的提取工艺，花青素的提取率为0.42%。结论该提取工艺可行，具有工艺流程简单和提取率高的优点。

凤丹牡丹花；花青素；比色法；提取工艺

牡丹Paeonia suffruticosa Andr.属芍药科芍药属植物，为我国特有。牡丹花作为观赏性花卉，享誉古今中外，并被尊为“花中之王”和“国花”［1］。其药用功效记载于《淄博本草》，牡丹花味苦、淡，性平，无毒，有调经活血的功效，主治妇女月经不调，经行腹痛［2］。2013年，菏泽凤丹牡丹花被国家卫生部批准为食品新原料。花青素是牡丹花色形成的物质基础，花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，存在于植物的花、果实和叶中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同的颜色。花青素广泛应用于治疗微循环失调、抗溃疡、抗炎症等，其含量测定主要有高效液相色谱（HPLC）法、对照品法和pH示差法，HPLC法主要用于测花青素单体的含量，对照品法和pH示差法均可用于测花青素总含量［3-4］。但花色素对照品很不稳定，限制了HPLC法的应用；pH示差法误差较大，且样品易浑浊。故本研究中采用对照品法来测定凤丹牡丹花花瓣中花青素的含量，对照品法以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为对照品，且通过单因素考察和正交试验优化了花青素的提取工艺，为开发利用牡丹花提供了依据。现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

KQ-500DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；U-2000型紫外可见分光光度计；RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵；B-220型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；BS11OS型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DZ-2BC型烘箱（天津市麦斯特仪器有限公司）。

1.2试药

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品（月旭科技有限公司，批号为10428，纯度大于98%）；牡丹花采自山东省菏泽市，经曹丹亮工程师鉴定为凤丹牡丹Paeoniaostii T.Hong et J.X.Zhang，5℃保存。

2　方法与结果

2.1花青素含量测定

2.1.1检测波长确定

用甲醇配制的对照品溶液和少量牡丹花提取液，在UV-2401PC紫外可见分光光度计的200～800 nm波长范围内扫描，分别得到对照品溶液和牡丹花提取液吸收光谱图，见图1 A和图1 B。综合分析后，选择536 nm波长作为牡丹花提取物中花青素吸光度的检测波长。

图1　光谱扫描曲线图

2.1.2方法学考察

标准曲线绘制：称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1 g/L的标准贮备液，备用。分别精密吸取0.10，0.75，1.00，1.25，1.50 mL贮备液置5 mL容量瓶中，用甲醇定容。在536 nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线，见图2。

图2　矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线图

精密度试验：精密吸取对照品溶液1.0 mL，按拟订条件进样测定6次。结果的RSD=0.96%（n=6），表明该仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取对照品溶液1.5 mL，分别于0，2，4，6，8，10 h时测定吸光度值。结果的RSD= 1.39%（n=6），表明该溶液在10 h内稳定。

重复性试验：称取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g 6份，乙醇浓度为70%，液料比为1∶10，16 kHz超声波下提取1次，提取时间为0.5 h。结果的RSD=1.63%（n=6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：分别精密吸取0.5，0.8，1.0，1.5，1.8，2.0 mL质量浓度为10 μg/mL的对照品溶液加入至6份已知含量为0.008 8%的牡丹花瓣，依法测定含量并计算回收率。结果的RSD=1.21%（n=6），表明该方法回收率良好。

2.2提取工艺单因素试验

2.2.1提取方法

温浸提取：称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，浸泡0.5 h，滤过，提取滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。结果花青素含量为0.088%。

回流提取：称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，回流提取0.5 h，滤过，提取滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。结果花青素含量为0.096%。

超声提取：称取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水温60℃，16 kHz超声提取0.5 h，滤过，提取滤液，减压回收溶剂，残渣加甲醇定容至10 mL容量瓶。结果花青素含量为0.167%。

可见，超声提取效果最佳。

2.2.2提取溶剂

称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比为1∶15，16 kHz超声波下提取1次，提取时间为0.5 h，考察水及不同体积分数乙醇对花青素提取率的影响。结果经水和10%，30%，50%，70%，90%乙醇提取后，花青素含量分别为0.086%，0.117%，0.134%，0.155%，0.169%，0.150%。可见，乙醇提取效果较好，且乙醇的体积分数在50%～70%效果最佳。

2.2.3提取时间

称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比为1∶10，70%乙醇，16 kHz超声波下提取1次，考察不同提取时间对花青素提取率的影响。结果提取10，15，20，25，30，40 min后，花青素含量分别为0.151%，0.175%，0.171%，0.165%，0.165%，0.157%。可见，提取时间在15～20 min最佳。

2.2.4液料比

称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇体积分数为70%，16 kHz超声波下提取1次，提取时间为0.5 h，考察不同液料比对花青素含量的影响。结果料液比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40时，花青素含量分别为0.162%，0.180%，0.181%，0.183%。可见，随着溶剂量的增加，花青素含量提高，溶剂量超过20倍时，溶剂量增加但提取率提高并不多，且液料比增大，给后期处理工序增加困难，增加生产成本，故料液比不宜太高，宜选择1∶15～1∶25。

2.2.5超声频率

称取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇体积分数为70%，在料液比为1∶10，不同超声频率下提取0.5 h。结果超声频率在16，24，32，40 kHz时，花青素含量分别为0.165%，0.179%，0.171%，0.163%。可见，花青素的提取率开始先随超声频率增加而增加，随后又随频率增加而减少，这与文献［5］的报道一致。这可能是因为随超声频率的增加，场内所产生的空化效应、粉碎等作用减弱，导致提取率变低，故选择频率为16～32 kHz。

2.3正交试验优化提取工艺

以乙醇体积分数（因素A）、提取时间（因素B）、料液比（因素C）、超声频率（因素D）等因素作为考察对象，分别单因素考察，找到相应合适的条件，然后对4因素、3水平进行L9（34）正交试验，以获取最佳工艺参数。根据以上单因素试验结果，因素A，B，C，D对花青素提取率具有重要影响。采用L9（34）因素水平表选用最佳提取参数，结果见表1和表2。以花青素含量为考察指标。由表2中极差R值大小显示，超声频率极差最大，其次为提取次数和液料比，提取时间极差相差最小。对于牡丹花花青素而言，各因素对提取效果影响的大小顺序为D＞A＞C＞B。通过直观分析方法，筛选出最佳提取方案A2B1C3D2，即称取适量牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超声提取12 min。

表1　因素水平表

2.4最佳工艺验证试验

称取适量牡丹花，在最佳提取条件下重复试验3次，取平均值，结果见表3。可见，牡丹花中花青素提取率平均达0.42%，该提取工艺稳定，提取率高。

2.5不同品种牡丹花花青素的含量测定

结果见表4。

3　讨论

本研究结果显示，采用超声方法提取，乙醇为提取溶剂有多种影响因素。通过单因素考察结果表明，乙醇体积分数、料液比、超声频率、提取时间对提取率有较大影响；正交试验结果表明，各因素对提取效果影响顺序为D＞A＞C＞B；通过直观分析方法，筛选出最佳提取方案A2B1C3D2，即称取适量凤丹牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超声提取12 min。该方法凤丹牡丹花中花青素提取率平均达0.42%，该提取工艺稳定，提取率高。与醇提法相比，水提花青素明显不够彻底，故不宜采用水提法。

表2　L9（34）正交试验设计与结果

表3　验证试验结果

表4　不同品种牡丹花花青素的含量

4个品种的凤丹牡丹花花瓣的花青素含量依次为红色牡丹（0.174%）、淡红色牡丹（0.154%）、紫色牡丹（0.778%）、黄色牡丹（0.083%）。

牡丹花除了作为观赏性花卉外，还有潜在的尚未开发的经济价值。本文对凤丹牡丹花花青素的提取工艺和花青素含量测定方法的建立，为开发利用牡丹花提供了依据。

［1］郭少霞，张玉刚，任茹.中国牡丹研究进展［J］.莱阳农学院学报，2003，20（2）：116-121.

［2］赵亦成，蒋纪洋.淄博本草［M］.北京：中国中医药出版社，1995：12.

［3］杨兆艳.pH示差法测定桑椹红色素中花青素含量的研究［J］.食品科技，2007，32（4）：201-203.

［4］吐尔洪，何文静，堵年生.紫外分光光度法测定木赛莱斯酒中花青素的含量［J］.中国民族医药杂志，2006，12（4）：54-55.

［5］郭孝武，张福成，林书玉，等.超声提取对黄连素提出率的影响［J］.中国中药杂志，1995，20（11）：673-675.

Study on Optimum Extraction Technology of Anthocyanidin in Paeoniaostii Flower

Zhang Zhichao1，Yu Huipan1，Yang Yuqin1，Xiao Shunli1，Cao Danliang2，Zhang Honggui1
（1.College of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China100102；2.Heze Jinfeng Lude Biotechnology Co.，Ltd.，Heze，Shandong，China274000）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of anthocyanidin inPaeoniaostii Flower.M ethodsThe contents of anthocyanidin were detected by colorimetric determination and the factors（ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and ultrasonic wave）were studied to compare their influence on the extraction ratio of anthocyanidin.Single factor tests were studied to compare the influence of ethanol concentration（10%-90%），solid-liquid ratio（1∶10-1∶40），extraction time（10-40 min），ultrasonic wave（16-40 kHz）on the extraction ratio of anthocyanidin.The influence of each factor was analyzed and the best extraction technology was determined.ResultsSingle factor tests gave the optimized arrange of factors as follows：ethanol concentration（70%-90%），solidliquid ratio（1∶15-1∶25），extraction time（10-25 min），ultrasonic wave（16-32 kHz）.Range analysis of orthogonal experiment showed that the influence of each factors in the extraction of anthocyanidin was ultrasonic wave＞ethanol concentration＞solid-liquid ratio＞extraction time.The best extraction condition was ratio of solid-liquid 1∶25，70%ethanol as solvent，24 kHz ultrasonic waveextractwith 12mineachtime.By theoptimizedextraction technology，theextractionratioof anthocyanidinwas0.42%. ConclusionThe extraction technology is feasible with efficient and simple process.

Paeoniaostii Flower；anthocyanidin；colorimetric determination；extraction technology

TQ461；R284．2；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0014－04

国家自然科学基金资助项目，项目编号：31070328。

张志超（1992-），男，硕士研究生，研究

方向为中药药效物质基础，（电子信箱）zhangzc5@ 163.com；张宏桂（1955-），男，教授，主要研究方向为中药药效物质的应用及体内代谢，本文通讯作者，（电话）010-84738642（电子信箱）bzy714@163.com。

（2016－05－01）