猪伪狂犬病病毒野毒抗体胶体金免疫层析试纸条的初步应用

雷有玲，张　文

（1.青海省海北州门源县北山乡兽医站，青海 门源 810300；2.青海畜牧兽医职业技术学院，青海 西宁 812100）

猪伪狂犬病病毒野毒抗体胶体金免疫层析试纸条的初步应用

雷有玲1，张文2

（1.青海省海北州门源县北山乡兽医站，青海 门源 810300；2.青海畜牧兽医职业技术学院，青海 西宁 812100）

为建立一种简单、快速、敏感、特异的猪伪狂犬病病毒野毒抗体血清学检测方法，本研究利用胶体金标记SPA蛋白作为金标垫，以重组gE蛋白和猪IgG分别作为检测线和质控线，组装检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条肉眼于15 min内即可判定结果，检测PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性，检测PRV野毒阳性血清的灵敏度达1∶1 280，与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为95.31%，室温条件下可稳定保存6个月以上。本研究研制的PRV野毒抗体胶体金免疫层析试纸条操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强，可用于PRV野毒感染的快速诊断，特别适合于现场检测。

猪伪狂犬病病毒；野毒抗体；gE蛋白；胶体金免疫层析；试纸条

猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物易感的一种急性、败血性传染病，猪是PRV的主要宿主和带毒者，可引起公猪不育，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，仔猪神经症状、腹泻，新生仔猪病死率可高达100%，成年猪常呈隐性感染、生长性能减慢、且终身带毒并排毒，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫接种是预防控制PR的重要手段，目前国内外普遍采用PRV gE基因缺失疫苗及配套的gE抗体鉴别诊断技术逐步对PRV野毒实行净化，由于gE基因缺失疫苗的广泛应用，我国有效控制了PR的发生与流行，但近几年来，国内养猪密集地区陆续出现PRV野毒感染的病例，PR发病率明显上升［1-2］，故急需加强对PRV野毒的监测。目前，PCR方法、荧光定量PCR方法、ELISA方法均已广泛应用于PRV野毒感染的检测中［3-4］，但诸多检测方法均存在对仪器设备与技术人员要求较高、操作复杂、检测周期较长（至少3 h）等缺陷。胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay，GICA）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫检测技术，具有不需特殊仪器设备、肉眼判读、操作简便、检测快速（一般20 min内完成检测）、敏感性高、特异性强等优点，特别适合于广大基层兽医人员和基层养猪生产单位使用。鉴于此，本研究在已成功表达PRV gE蛋白的基础上，将其纯化后作为检测线，同时以胶体金标记SPA蛋白作为金标垫，以猪IgG作为质控线，组装了具有自主知识产权的检测猪伪狂犬病毒gE抗体的胶体金免疫层析试纸条，旨在为我国PRV野病毒感染的快速诊断提供一种操作简单、敏感、特异的血清学诊断方法。

1　材料与方法

1.1重组质粒、菌株与血清表达PRV gE蛋白的重组质粒pET30a-gE、表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，均由青海畜牧兽医职业技术学院兽医实验室制备并保存；猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病病毒（PPV）、PRV疫苗毒阳性血清、PRV野毒阳性血清、PRV阴性血清，均由青海畜牧兽医职业技术学院兽医实验室保存；临床血清样品464份由青海畜牧兽医职业技术学院兽医实验室收集并保存。

1.2试剂与试剂盒His-Tag蛋白纯化试剂盒为Life Technologies公司产品；纯化的猪IgG，购自上海易佰聚生物公司产品；葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA）为Prospec公司产品；玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水垫、背衬均为Millipore公司产品；PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒为IDEXX公司产品。

1.3重组抗原的制备与鉴定参照文献［1］的方法，将pET30a-gE阳性重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，经1.0 mmol/L IPTG诱导4 h后，离心收集菌体，超声波破碎细胞，参照His-Tag蛋白纯化试剂盒使用说明书分离纯化重组蛋白，利用考马斯亮蓝染色方法测定纯化蛋白的浓度，利用SDS-PAGE电泳分析纯化蛋白的纯度，利用Western Blot鉴定纯化蛋白的活性。

1.4胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，取100 mL超纯水倒入250 mL锥形瓶中，滴加1.0%氯金酸溶液1.0 mL，置于磁力搅拌器中连续搅拌并加热至沸腾，搅拌下快速加入1.0%柠檬酸三钠溶液1.8 mL，此时溶液逐渐由浅黄色变为灰黑色最后变为橙红色，待溶液变为橙红色后继续加热15 min，冷却至室温，0.1 mol/ mL K2CO3调节溶液pH值至6.5左右，超纯水定容至100 mL后，置于棕色瓶中4℃保存备用。

1.5SPA金标复合物的制备取20 mL制备的胶体金于50 mL小烧杯，在快速搅拌下滴加0.2 mL SPA（1.0 mg/mL），继续搅拌30 min，加入BSA至终浓度为1%，继续搅拌30 min。8 000 r/min（4℃）离心45 min，弃上清，沉淀用含0.5%PEG 20 000的0.05 mol/L PBS洗涤2次后，用2.0 mL含1% BSA的0.1 mol/L PBS重悬，置于棕色瓶中4℃保存备用。

1.6胶体金免疫层析试纸条的组装将玻璃纤维用含2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐温20的0.1 mol/ L PBS封闭后，置于37℃恒温箱，待干燥后即得样品垫；将SPA金标复合物喷涂于样品垫上，真空干燥后即得SPA金标结合垫；将猪IgG（2.0 mg/ mL）和PRV gE纯化蛋白（1.0 mg/mL）分别划线于硝酸纤维素膜的质控线和检测线上。依次将样品垫、SPA金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸粘贴在塑料背衬上，组装胶体金免疫层析试纸条。

1.7判断标准的确定取100 μL检测样品滴于试纸条的样品垫上，10～15 min内判断结果。检测线与质控线均出现红色线，检测样品为阳性；检测线不显色，质控线出现红色线，检测样品为阴性；质控线不显色，试纸条失效。

1.8交叉反应试验利用组装的胶体金免疫层析试纸条分别检测PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒、PRV野毒阳性血清、PRV阴性血清，确定PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条的特异性。

1.9敏感性试验将PRV野毒阳性血清用灭菌PBS依次做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶ 320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560倍比稀释，确定PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条的敏感性。

1.10重复性试验

1.10.1批内重复性试验选取4份PRV野毒抗体阳性血清样品和4份PRV阴性血清样品，每份血清样品平行做4个重复，用同一批次PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条进行检测，确定试纸条的批内重复性。

1.10.2批间重复性试验选取4份PRV野毒抗体阳性血清样品和4份PRV阴性血清样品，用4批不同批次的PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条进行检测，确定试纸条的批间重复性。

1.11符合性试验利用本研究组装的PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条和IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒同时检测128份血清样品，统计计算试纸条相对于进口试剂盒的符合率，确定试纸条的准确性。

1.12保存期试验将试纸条密封后置于室温中，每隔30 d进行交叉反应和敏感性检测，比较分析检测结果，确定试纸条的保存期。

1.13临床应用应用本研究组装的PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条检测2012-2014年收集于国内部分地区的464份血清样品，了解掌握近3年国内PRV野毒感染抗体阳性率，并确定PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条的临床适用性。

2　结果与分析

2.1诊断抗原的制备与鉴定结果经SDS-PAGE电泳检测表明，重组gE蛋白以包涵体形式表达，其分子量大小为33 ku，经His-Tag蛋白纯化试剂盒纯化后，纯度达90%以上，浓度达1.7 mg/mL，Western Blot检测表明，重组蛋白具有较好的反应活性，与我们以前的报道结果完全一致［1］。

2.2交叉反应试验结果如图1所示，利用组装的胶体金免疫层析试纸条检测PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒阳性血清、PRV阴性血清均呈阴性反应，而检测PRV野毒阳性血清呈阳性反应，表明组装的试纸条具有良好的特异性。

图1　交叉反应试验结果

图2　敏感性试验结果

2.3敏感性试验结果如图2所示，利用组装的胶体金试纸条检测倍比稀释的PRV野毒阳性血清，当血清稀释至1∶1 280时，检测结果仍为阳性，表明组装的试纸条具有良好的敏感性。

2.4重复性试验结果4份PRV野毒抗体阳性血清样品和4份PRV阴性血清样品的批内重复性试验和批间重复性试验的检测结果均完全一致，表明组装的试纸条具有良好的重复性。

2.5符合性试验结果如表1所示，利用本研究组装的PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条和IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒同时检测128份血清样品，IDEXX gE-ELISA试剂盒检测出阳性33份，阴性95份，而胶体金试纸条检测出阳性35份，阴性93份。IDEXX gE-ELISA检测为阳性的33份样品，胶体金试纸条检测出阳性31份；IDEXX gE-ELISA检测为阴性的95份样品，胶体金试纸条检测出阴性91份，二种方法检测结果相同的样品共计122份，二者的符合率为95.31%（122/128），PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条显示出了良好的准确性。

表1　符合性试验结果

2.6保存期试验结果将试纸条密封置于室温保存6个月后，检测结果表明，其特异性和敏感性均未发生任何变化，表明该试纸条可在室温条件下保存半年以上。

2.7临床应用结果应用本研究组装的PRV gE抗体胶体金免疫层析试纸条检测2012-2014年收集于国内部分地区的464份血清样品，检出阳性62份，血清抗体阳性率为13.36%（62/464），胶体金试纸条方法检测快速、操作简单、敏感、特异，表现出了良好的临床适用性。

3　讨论

近几年来，PR在我国猪群中陆续流行，要想根除该病，除靠疫苗免疫接种外，还应加强PRV野毒感染的监测并及时淘汰隐性感染猪，才能逐步实现PR的净化。因此，敏感、特异、准确的PRV野毒感染诊断技术是PR净化的关键。尽管本实验室已经利用gE蛋白建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法，但该方法对酶标仪和专业技术人员的依赖性较高，限制了其在基层兽医工作者和养殖单位中的普遍应用。而本试验利用gE蛋白建立的检测PRV野毒抗体的胶体金免疫层析试纸条无需任何仪器设备，肉眼于15 min内即可判定结果，操作简单、检测快速，且该方法检测PCV-2、PRRSV、PEDV、CSFV、PPV、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性，检测PRV野毒阳性血清的灵敏度达1∶1 280，室温条件下可稳定保存6个月以上，与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为95.31%。虽然该胶体金试纸条与进口ELISA试剂盒符合率高达95%以上，但试纸条阳性检出率仍然偏高，究其原因可能与原核表达包涵体蛋白的非特异性反应有关，本实验室将进一步加强对重组蛋白的纯化工作，逐步提高试纸条的特异性和准确性。总之，本研究研制的胶体金试纸条已具备了相对良好的特异性、敏感性、重复性、稳定性、准确性和临床适用性，可以用作血清中PRV野毒感染抗体的快速筛查，对于阳性血清样品可用其他分子生物学或ELISA方法进行复核，这将大大缩短检测周期，降低检测成本，在基层兽医工作人员和基层养猪生产单位中将具有广阔的应用前景，同时为我国PRV野毒感染的现场快速检测提供了一种价格低廉、敏感、特异的血清学诊断技术。

［1］邹敏，杨旭兵，郑辉，等.2012-2013年我国部分地区猪伪狂犬病流行病学调查［J］.中国动物检疫，2015，32（4）：1-5.

［2］占松鹤，刘华，周迎春，等.安徽省规模化种猪场猪伪狂犬病血清学调查［J］.动物医学进展，2015，36（3）：124-127.

［3］张婕，李增奎.应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究［J］.安徽农业科学，2014，42（9）：30-31.

［4］吕素芳，郭广君，李峰，等.SYBR Green I荧光定量PCR检测猪伪狂犬病毒gE基因缺失病毒株方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2014，36（2）：38-42.

S858.28

A

0529-6005（2016）09-0035-03

2015-05-13

雷有玲（1983-），女，兽医师，本科，从事动物防疫及检疫工作，E-mail：leiyouling1980@126.com