全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用

李林臣 张懿晖 牛艳芬 李芙琴 谢桂芳

全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的应用

李林臣①张懿晖①牛艳芬①李芙琴①谢桂芳①

目的：探讨全自动化学发光分析仪及核酸扩增仪检测乙肝标志物的临床应用。方法：选择2235例住院及门诊收治的肝功能异常病例，分别用化学发光方法检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg），用实时荧光聚合酶链式反应（FQ-PCR）方法检测乙肝病毒基因（HBV-DNA）含量，并对结果进行分析。每位患者检测HBsAg与HBV-DNA均采用同一份标本。结果：全部受检标本中，化学发光方法检测HBsAg阳性率为61.34%，显著高于FQ-PCR方法检测阳性率（48.59%），差异有统计学意义（x2=73.41，P＜0.01）。将化学发光检测HBsAg的结果分成强阳性、弱阳性和阴性3组，不同组间FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性率显著不同，差异有统计学意义（x2=1863.60，P＜0.01），强阳性组HBV-DNA阳性率为97.31%，显著高于弱阳性组，差异有统计学意义（x2=966.90，P＜0.01）。结论：全自动化学发光分析仪所采用的化学发光方法对筛查乙肝病毒感染效果较好，而扩增仪所采用的FQ-PCR方法对检测乙肝病毒复制及疗效的监测效果更好，二者联合检测可提高乙肝患者的检出率并可对乙肝患者的病情及疗效作出准确判断。

全自动化学发光仪；聚合酶链式反应；扩增仪；乙肝表面抗原；乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸

［First-author’s address］ The Number One Hospital Department Laboratory， the Number One Hospital of Zhangjiakou，Hebei Province， 075000， China.

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的传染性疾病，而我国是乙型肝炎的高流行区，慢性携带率约为10%。目前，临床上检测乙型肝炎标志物常用方法主要有酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化学发光法以及荧光定量-聚合酶链反应（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）法［1-2］。本研究将化学发光检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）FQPCR检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（hepatitis B virus-Deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）的结果进行比较，分析其在乙型肝炎筛查中的作用，以期更好的指导临床应用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2013年1月至2014年8月在张家口市第一医院消化科住院及门诊收治肝功能异常的2235例患者，其中男性1057例，女性1178例；年龄19～87岁，平均年龄为45.6岁。所有患者血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）＞40 U/L、谷氨酸转氨酶（ALT）＞40 UL及r-谷氨酰转移酶（GGT）＞50 U/L。

1.2 纳入与排除标准

（1）纳入标准：①无其他传染病或者感染别的病毒的患者；②在采血前未对乙型肝炎进行治疗的患者。

（2）排除标准：患有对实验结果具有重大影响的疾病如：严重肾脏疾病、严重免疫性疾病及严重的营养不良等疾病患者。

1.3 仪器与试剂

全自动化学发光仪CHEMCLIN 600及其原装试剂均购自北京科美生物有限公司，LightCycler 480实时荧光定量PCR核酸扩增仪购自罗氏公司（瑞士），乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒由凯杰生物工程有限公司（深圳）提供。

1.4 检测方法

对患者进行空腹采集静脉血，并离心分离血清，使用全自动化学发光分析仪，采用化学发光方法检测患者血清中的HBsAg。严格按照仪器和试剂说明书及医院标准作业程序（SOP）文件进行操作；血清中HBsAg≥0.5 ng/ml为阳性，其中≥30 ng/ml为强阳性，30 ng/ml＞HBsAg≥0.5 ng/ml为弱阳性。使用核酸扩增仪，采用FQ-PCR法检测患者血清中HBV-DNA含量；拷贝数＞500 copies/ml为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，采用x2检验对两种方法的检测结果进行比较，四格表中不同组间两两比较采用x2分割法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测结果比较

在2235例患者标本中，采用化学发光检测HBsAg与FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性率不同，化学发光的阳性率为61.34%，高于FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性率（48.59%），其差异有统计学意义（x2=73.41，P＜0.01）。

表1 2235例标本HBsAg阳性率与HBV-DNA含量结果的比较(例)

2.2 不同HBsAg检测结果下HBV-DNA的检测结果分析

根据化学发光检测HBsAg的结果，将2235例病例分成强阳性、弱阳性和阴性3组，不同组间FQPCR检测HBV-DNA的阳性率不同（x2=1863.60，P＜0.01）。不同组间两两比较HBV-DNA的阳性率均有统计学意义（x2=966.90，x2=1703.94，x2=66.93；P＜0.01），强阳性组DNA阳性率为97.31%，显著高于弱阳性组，见表2。

表2 不同组间HBsAg与HBV-DNA的检测结果比较(例)

3 讨论

乙型肝炎病毒具有抵抗力强、嗜肝性、变异性以及致癌性等特点，且乙型肝炎病毒对人群普遍易感，其感染后，往往呈隐性感染，转变为慢性乙型肝炎［4］。而慢性乙型肝炎可以引起肝脏炎症和纤维化，如不及时治疗，部分患者可发展为肝硬化，失代偿期肝硬化预后较差，且容易进展为肝细胞癌［5-6］。部分乙型肝炎病毒感染也可以出现急性肝炎，严重者可以发展为爆发性肝炎甚至肝细胞癌，对人体健康造成严重影响［7］。HBsAg、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）以及乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）作为最经典的诊断乙型肝炎病毒感染的标志物得到临床的认可和广泛应用［8］。而早期检测乙肝免疫标志物的方法常采用酶联免疫吸附法进行检验，不仅价廉迅速，而且操作简便，能够用于大批量筛查，但是灵敏度、特异度不是很好，且误诊率较高［9］。血清HBsAg仅标志HBV感染，不反应病毒复制强度，HBsAg阴性也不能够完全排除HBV感染的存在，可能是由于病毒被迅速清除或表达水平低，也可能是检测试剂的局限性（包被抗体的结合位点发生变异等）所致［10］。所以仅仅检测乙型肝炎免疫标志物已远远不能满足临床的需要。近年来，乙型肝炎患者血清前S1抗原检测已被应用于临床，作为乙型肝炎感染诊断的辅助指标，在降低乙型肝炎感染诊断假阴性率中表现出较好的效果［11］。

在临床上用于诊断乙型肝炎感染的指标中除了乙型肝炎免疫标志物外，应用最广泛的就是用实时荧光聚合酶链反应技术检测HBV-DNA。HBV-DNA 主要反映患者体内的HBV感染及复制情况，也可作为判断乙型肝炎病毒传染性强弱的金标准［12］。并且HBV-DNA定量分析在监测抗病毒药物疗效上有重要的指导作用和临床意义［13］。而长期以来，临床一直是以HBeAg和HBVDNA定量分析来作为诊断和治疗的金标准，但是约有30%的患者在HBeAg转阴后，病毒仍在体内复制，其中部分可以发展为肝硬化或肝癌［14-15］。

本研究用全自动化学发光分析仪所采用的化学发光方法和LightCycler480核酸扩增仪所采用的实时荧光PCR方法对HBsAg和HBV-DNA进行检测，并对两种方法的阳性率进行比较分析。全自动化学发光分析仪所采用的化学发光技术利用化学反应释放的能激发中间体，使其由激发态回到基态，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级光子，对光子进行测定而进行定量分析，具有和放射免疫分析相似的灵敏度和特异性［16］。LightCycler480核酸扩增仪所采用的FQPCR技术是模拟病毒天然复制过程进行检测的一项技术，具有高特异性、高灵敏度的特点，而且能够直接检测患者体血清中的HBV-DNA含量［17］。同时还能够区别患者是否为早期的乙型肝炎病毒感染，还是现症感染及恢复期感染，也可以对乙型肝炎病毒出现突变株予以诊断［6］。

本研究选择用肝功能异常（AST＞40 U/L、ALT＞40 UL、GGT＞50 U/L）作为标本纳入标准是因为肝功能指标的增高与肝脏炎症程度有密切关系［18］。

表1中化学发光的阳性率高于FQ-PCR，表明化学发光定量检测HBsAg具有更高灵敏度，因此临床研究多将其作为参考方法［19］。在表2中，根据化学发光检测HBsAg的结果分成强阳性、弱阳性和阴性3组，强阳性组HBV-DNA阳性率显著高于弱阳性组。本研究认为其原因有两种情况：①在弱阳性组中有很大部分乙型肝炎患者为非活动性HBsAg携带者，病毒复制处于静止期，此类患者血清HBsAg呈阳性，而HBVDNA为阴性或低于检测下限，因此化学发光方法检测HBsAg因其灵敏度高且特异性好，可以有效的提高筛查阳性率减少假阴性率，所以对乙肝患者的筛查很有意义［17，20］；②在弱阳性组中由于患者体内抗原具有滞后性，因此当患者体内的HBV-DNA消失后一段时间内，其抗原成份HBsAg还存在而被检查出来，导致阳性率降低。在表2的HBsAg阴性组中有HBV-DNA阳性患者，表明检测HBV-DNA来诊断乙型肝炎病毒感染的窗口期要比检测HBsAg诊断乙型肝炎病毒感染的窗口期短。而且用FQ-PCR方法检测HBV-DNA含量，对其乙型肝炎病情监测、疗效评估更有意义，两种方法各有优势。故二者联合检测不但可以在筛查乙型肝炎患者中有效的提高阳性率并且缩短窗口期，而且在临床上可以及早作出诊断并对患者病情及治疗情况作出准确判断评估。

4 结语

在临床上，使用全自动化学发光分析仪与实时荧光定量PCR核酸扩增仪联合检测乙型肝炎标志物，既可提高乙型肝炎患者的检出率缩短窗口期，又可以对乙型肝炎患者的病情及疗效进行准确判断及评估。

［1］胡成进，公衍文，丛玉隆，等.检验结果临床解读［M］.2版.北京：人民军医出版社，2010：306-308.

［2］温绍霞.不同方法检测乙肝标志物的结果分析［J］.中国社区医师：医学专业，2012，14（25）：255.

［3］薛芳芳，赵婷婷.三种方法检验乙型肝炎血清标志物结果评价［J］.现代仪器与医疗，2014（05）：73-75.

［4］张菊萍，王珍.FQ-PCR、TRFIA方法检测乙肝标志物的临床价值［J］.山东医药，2014（5）：45-46.

［5］Chen YC，Chu CM，Yeh CT，et al.Natural course following the onset of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B：a lon-term follow-up study［J］.Hepatol Int，2007，1（1）：267-273.

［6］Chu CM，Liaw YF.Hepatitis B virus-related cirrhosis：natural history and treal ment［J］.Semin Liver Dis，2006，26（2）：142-152.

［7］秦望森.两种检测乙肝血清学标志物方法的临床对比［J］.中国老年学杂志，2011，31（14）：277-279.

［8］刘毅，王波，黄小川，等.乙型肝炎血清学免疫标志物与病毒核酸含量的相关性研究［J］.中国实验诊断学，2013（12）：2185.

［9］施志农，陈继梅.154例乙型肝炎患者HBV-M、HBV-DNA、肝功能检测结果分析［J］.中华全科医学，2011，9（6）：966-968.

［10］刘毅，王波，黄小川，等.乙型肝炎血清学免疫标志物与病毒核酸含量的相关性研究［J］.中国实验诊断学，2013（12）：2187.

［11］符斌华.乙肝感染者血清前S1抗原检测在降低乙肝感染诊断率中的价值评价［J］.基层医学论坛，2015，19（22）：3053-3054.

［12］陈光辉，孙长义，赵静.HBV血清学标志物与HBVDNA荧光定量相关性分析［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2013，27（2）：1908-1910.

［13］龙智钢，刘运芝，黄一伟.HBV-DNA与乙型肝炎血清学标志物的相关性研究［J］.实用预防医学，2011，18（8）：1538.

［14］程钢，何藴韵，周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒［J］.中华医学检验杂志，1999，22（3）：135.

［15］Peng XM，Huang GM，Li JG.Etal.High level of hepatitis B virus DNA after HBeAg to anti-Hbeseroconversion is relateal to coexistence of mutations in its precore and basal core promoter［J］.World Gastroenterol，2005，11（20）：3131.

［16］丛玉隆.实用检验医学［M］.北京：人民卫生出版社，2009：807.

［17］林骏，刘尧.实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用［J］.吉林医学，2012，33（3）：493.

［18］曹灵芝，王靖.慢性乙肝患者血清肝功能指标、HBV标志物定量与肝组织病理学改变的关系［J］.山东医药，2014，54（19）：40-41.

［19］王宇明，周吉军，程林.乙型肝炎病毒血清学标志物定量检测方法比较及其应用［J］.中华肝脏病杂志，2011，19（11）：812-814.

［20］刘宇静，吴学军，刘晔.荧光定量PCR检测HBVDNA与化学发光酶免疫法检测乙肝五项的相关性调查［J］.标记免疫分析与临床，2014（2）：197-200.

Comparison of Chemiluminescence immunoassay and real-time PCR of in HBV markers detection

LI Lin-chen， ZHANG Yi-hui， NIU Yan-fen， et al// China Medical Equipment，2016，13（4）：41-44.

Objective： To investigate the clinical applications of chemiluminescence immunoassay and real-time PCR in HBV markers. Methods： We select 2235 inpatients and outpatients of GI Medicine in our hospital from 2013 to 2014. Detect surface antigen of hepatitis B virus （HBsAg） and Hepatitis B virus gene （HBV-DNA） of every sample by chemiluminescence immunoassay and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR），respectively. And analyze the results. The same specimen was used to detect the surface antigen of hepatitis B virus and HBV-DNA in each patient. Results： In 2235 case， the positive rate of chemiluminescence immunoassay detecting HBsAg was 61.34%， which was higher than the positive rate of FQ-PCR（48.59%， x2=73.41， P＜0.01）. Grouping the results of chemiluminescence immunoassay into strong positive， weak positive and negative. There were statistical difference（x2=1863.60， P＜0.01） among the positive rate of FQ-PCR detecting HBV-DNA. The statistical difference（x2=966.90，P＜0.01） of HBV-DNA’s positive rate was found between strong positive group （97.31%） and weak positive group （15.41%）. Conclusion： It is better to screen HBV infected persons by chemiluminescence immunoassay， while it is better to detect the replication of hepatitis B virus and the efficacy by FQ-PCR. Combined utilization can improve the detection rate and make accurate judgments of the condition of patients and treatment effects.

Fully automatic chemiluminescence analyzer； Real-time fluorescence quantitative PCR； HBsAg； Hepatitis B virus-Deoxyribonucleic acid

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.04.013

1672-8270（2016）04-0041-04

R197.39

A

2015-07-03

①张家口市第一医院检验科 河北 张家口 075000

李林臣，男，（1981- ），本科学历，主管技师。张家口市第一医院检验科，研究方向：乙型肝炎的免疫学诊断。