低剂量照射诱导人淋巴细胞53BP1焦点形成的剂量-效应关系研究*

徐 岩 封江彬 陆 雪 李 爽 高 玲 田 梅 蔡恬静 刘青杰*

低剂量照射诱导人淋巴细胞53BP1焦点形成的剂量-效应关系研究*

徐 岩①封江彬①陆 雪①李 爽①高 玲①田 梅①蔡恬静①刘青杰①*

目的：探讨低剂量60Coγ射线照射诱导人永生化淋巴细胞AHH-1中P53结合蛋白1（53BP1）焦点水平与照射剂量之间的关系。方法：用60Coγ射线照射AHH-1细胞，照射剂量分别为0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100和200 mGy，吸收剂量率为20 mGy/min，37 ℃修复30 min后进行免疫荧光染色，利用激光共聚焦扫描显微镜分析细胞中53BP1焦点形成情况。结果：在剂量为0～200 mGy的60Coγ射线照射30 min后，AHH-1细胞中53BP1焦点在每个细胞中的数目为0～4个，均符合泊松分布。从50 mGy照射剂量开始53BP1焦点水平显著性增加，且焦点水平与照射剂量具有剂量-效应关系，剂量-效应曲线为y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236，P＜0.01）。结论：在低剂量电离辐射作用下，53BP1焦点水平具有较好的剂量-效应关系。

低剂量照射；60Coγ射线；免疫荧光；P53结合蛋白1

［First-author’s address］ China CDC Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency， National Institute for Radiological Protection， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 100088， China.

P53结合蛋白1（53BP1）是重要的DNA损伤修复蛋白，当细胞受到电离辐射作用时，53BP1会在DNA双链断裂处募集，表现为经过免疫荧光染色后可在激光共聚焦扫描显微镜下观察到发光的焦点［1］。53BP1可以通过调节非同源性末端连接和同源重组修复两种主要的双链断裂修复途径的选择，通过多种组蛋白修饰来结合损伤的染色质，阻断5′端的末端切除并且促进染色质的运动和联会等方式参与到DNA损伤修复［2］。本研究利用低剂量60Coγ射线照射永生化淋巴细胞系AHH-1，通过探索53BP1焦点发生率与受照剂量的关系，为探讨53BP1作为低剂量电离辐射标志物提供进一步理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

激光共聚焦扫描显微镜型号为LSM700（德国，Zeiss公司）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、4%多聚甲醛以及4`，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，激发波长：345 nm；发射波长：455 nm）等其他试剂均为国产分析纯。53BP1兔多克隆抗体购自美国abcam公司；Alexa fluor 594（激发波长：591 nm；发射波长：614 nm）驴抗兔IgG购自美国Jackson公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自中国金耀生物公司；永生化淋巴细胞系AHH-1购于北京曼哈顿医学生物技术公司。

1.2 细胞培养和照射

AHH-1细胞在含体积分数为10%小牛血清、105U/L青霉素和质量浓度水平为100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃饱和湿度的含体积分数为5%的CO2培养箱中培养至对数生长期。将处于对数生长期的淋巴细胞换液，在室温下用60Coγ射线进行照射，吸收剂量分别为0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy，照射源由中国计量院提供，放射性活度为9.25×1010Bq，吸收剂量率为20 mGy/min，吸收剂量校准溯源于中国计量院国家级实验室，照射野直径为99.3 mm，源靶距为1.24 m。照射后置于37 ℃恒温箱培养30 min进行试验。

1.3 免疫荧光染色技术检测53BP1焦点形成

将AHH-1细胞用1×PBS室温下洗5 min×3遍，4%多聚甲醛溶液于室温下固定15 min，1×PBS洗5 min×3遍。0.2%的TritonX-100室温下破膜15 min，1×PBS洗5min×3遍。37 ℃环境下用3%BSA封闭30 min，1×PBS洗5 min×3遍。加入53BP1兔多克隆抗体（用1%BSA按照1∶100稀释），4 ℃孵育过夜。第2 d取出，1×PBS洗5 min×3遍。加入荧光二抗37 ℃孵育1 h，1×PBS洗5 min×3遍。加入50 µl 1×PBS，将细胞打匀，滴在玻片上，室温下自然晾干，用DAPI AF封片10 min后上机观察53BP1焦点数并做记录（Pinhole=54 µm，Digital gain=1）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各组53BP1焦点的分布采用单样本K-S检验，P＞0.05为符合泊松分布。各组间53BP1焦点发生率的差异用U检验，53BP1焦点发生率的剂量-效应曲线用一元线性回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光技术观测53BP1焦点形成

用免疫荧光技术观察AHH-1细胞，在0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy6个剂量水平各观察1000个细胞，分析53BP1的焦点发生水平（焦点数/细胞），可观察到永生化淋巴细胞AHH-1受低剂量电离辐射作用30 min后，包括对照组在内的各剂量水平照射组均可见53BP1焦点形成，为0～4个焦点/细胞（如图1所示）。

图1 60Co γ射线照射AHH-1细胞中53BP1焦点形态图(×1000)

经K-S检验各受照剂量组渐进显著性均＞0.05，表明53BP1焦点在细胞内分布符合泊松分布。形成的焦点数目除10 mGy照射组有所减少，其余组随吸收剂量的增加而升高；各照射组与未照射组比较，在50 mGy以上各组均有统计学意义（U=3.349，U=4.061，U=5.966；P＜0.01），见表1。

2.2 低剂量照射诱导的53BP1焦点水平的剂量-效应曲线60Coγ射线照射AHH-1细胞后30 min，在0～200 mGy吸收剂量范围内53BP1焦点水平（均数±标准差）随剂量的增加呈上升趋势，且具有较好的剂量-效应关系。采用一元回归线性分析拟合曲线如下：y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2，（R2=0.9236，P＜0.01）。其中y代表53BP1焦点形成水平，x代表吸收剂量，如图2所示。

图2 不同剂量60Co γ射线照射AHH-1细胞53BP1焦点形成水平剂量-效应曲线图

表1 不同剂量60Coγ射线照射AHH-1细胞培养30 min后53BP1焦点形成分布

3 讨论

目前，核能在世界范围内的医学领域利用越来越普遍。X射线计算机断层摄影术在诊断中的应用、核医学PET/CT应用飞速的发展以及肿瘤放射治疗等均可导致医疗照射和职业照射等。这些情况下，除放射治疗外，照射多为低剂量辐射，因而寻求高效、快捷简便而准确的低剂量电离辐射剂量估算方法具有十分重要的价值。

研究发现，细胞受到电离辐射照射后，组蛋白H2AX在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）家族成员毛细血管共济失调突变基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、ATM和Rad3相关蛋白（ATM and Rad3 related protein，ATR）及DNA依赖性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）等的作用下，距离C端较近的丝氨酸139位在1～3 min内发生磷酸化形成γH2AX，并在30 min内都可以保持较高的表达水平［3］。在DNA损伤修复反应早期，组蛋白H2AX的磷酸化（γH2AX）是最早发生的分子事件之一，在数个至数十个毫戈瑞（mGy）照射后即可观察到γH2AX焦点形成［4-5］。而γH2AX则可以在DNA损伤位点募集53BP1参与DNA损伤修复，表现为经过免疫荧光染色处理后可见发光的焦点，也使得53BP1具有成为低剂量辐射生物标志物的潜力［1，6］。

53BP1也是重要的DNA双链损伤标志物之一，其基因位于染色体15q15-21，有11 kb和6.6 kb两种转录产物，其可参与到DNA损伤修复和调节细胞周期以保护基因组稳定性［7］。Lamkowski等［8］用60Coγ射线照射小猪后发现53BP1焦点形成水平有剂量-效应关系。Horn等［9］将53BP1、γH2AX同淋巴细胞亚群中含半胱氨酸的天门冬氨酸蛋白水解酶激活情况结合共同估算电离辐射受照剂量。这些结果均表明53BP1表达水平有望成为与剂量相关的新型辐射生物标志物。

本研究利用免疫荧光染色技术，通过观察AHH-1细胞受到低剂量60Coγ射线照射后53PB1的焦点形成水平，试图初步探讨在低剂量电离辐射水平照射，即0～200 mGy之间且吸收剂量率＜20 mGy/min的条件下，53BP1焦点形成水平的剂量-效应关系，以期为寻找低剂量相关辐射生物标志物提供科学依据。研究结果显示，53BP1在照射后30 min焦点形成在50～200 mGy剂量范围内呈增加趋势，且存在较好的剂量-效应关系。50 mGy剂量以下并未见明显变化，可能是因为53BP1表达过低，也可能是因为随着DNA损伤的修复53BP1逐渐消失［10］。本研究将照射后细胞修复时间定为30 min，是鉴于53BP1的表达在受照后30 min处于最高水平，30 min后表达水平迅速下降［10］。

4 结语

人淋巴细胞53BP1蛋白焦点形成水平在低水平电离辐射作用下具有较好的剂量-效应关系，其可用作检测低水平电离辐射所致的DNA双链损伤，53BP1有望成为一种快捷高效的与低剂量相关辐射生物标志物。

［1］Huyen Y，Zgheib O，Ditullio RA Jr，et al. Methylated Iysine 79 of histone H3targets 53BP1 to DNA double-strand breaks［J］.Nature，2004，432（7015）：406-411.

［2］Michal Zimmermann，Titia de Langeemail.53BP1：pro choice in DNA repair［J］.Trends Cell Biol，2014，24（2）：108-117.

［3］An J，Huang YC，Xu QZ，et al.DNA-PKcs plays a dominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression［J］.BMC Mol Biol，2010，11：18.

［4］Jeggo PA，Löbrich M.Artemis links ATM to double strand break rejoining［J］.Cell Cycle，2005，4（3）：359-362.

［5］Rothkamm K，Balroop S，Shekhdar J，et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT：a quantitative biomarker of low-level radiation exposure［J］.Radiology，2007，242（1）：244-251.

［6］Bekker-Jensen S，Lukas C，Melander F，et al. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1［J］.J Cell Biol，2005，170（2）：201-211.

［7］Iwabuchi K，Bartel PL，LiB，et al.Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（13）：6098-6102.

［8］Lamkowski A，Forcheron F，Agay D，et al. DNA damage focus analysis in blood samples of minipigs reveals acute partial body irradiation［J］.PloS One，2014，9（2）：e87458.

［9］Horn S，Barnard S，Brady D，et al.Combined analysis of gamma-H2AX/53BP1 foci and caspase activation in lymphocyte subsets detects recent and more remote radiation exposures［J］. Radiat Res，2013，180（6）：603-609.

［10］Marková E，Schultz N，Belyaev IY.Kinetics and dose-response of residual 53BP1/gamma-H2AX foci：co-localization，relationship with DSB repair and clonogenic survival［J］.Int J Radiat Biol，2007，83（5）：319-329.

Research on dose-response of 53BP1 foci level in human lymphoblastoid cells induced by low dose irradiation

XU Yan， FENG Jiang-bin， LU Xue， et al// China Medical Equipment，2016，13（4）：106-108.

Objective： To investigate the dose- response relationship between the levels of 53BP1 foci in the lymphocyte cells AHH-1 and the absorbed doses of low dose irradiation. Methods：Lymphocyte cells AHH-1 were exposed to different absorbed dose levels of60Co γ-rays （0， 10， 25，50， 100 and 200 mGy at the absorbed dose-rate of 20 mGy/min）. Immunofluorescence analysis was carried out 30 min after irradiation and the formation of 53BP1 foci （foci/per cell） was analyzed using laser scanning confocal fluorescence microscope. Results： Within the dose range of 0-200 mGy， the levels of 53BP1 foci were conformed to the Poisson distribution. The levels of 53BP1 were enhanced when the dose level was above 50 mGy， and the dose-response curve was well fitted as y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236， P＜0.01）. Conclusion： There is a good dose-response relationship between the levels of 53BP1 foci and the low doses， and hence it could be applicable as a biomarker of low dose radiation.

Low dose irradiation；60Co γ-rays； Immunofluorescence； 53BP1

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.04.033

1672-8270（2016）04-0106-03

R144.1

A

2015-05-10

国家自然科学基金（81573081）“人外周血淋巴细胞核质桥作为快速辐射生物剂量计的研究”；国家自然科学基金（81172593）“GDF15和PIG3基因表达变化作为快速辐射生物剂量计的研究”

①中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 辐射防护与核应急中国CDC重点实验室 北京 100088

*通讯作者：qjliu@nirp.cn

徐岩，男，（1989- ），硕士研究生。中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 辐射防护与核应急中国CDC重点实验室，从事辐射损伤生物标志物研究工作。