2015年四川省风疹病毒分离株的基因特征分析

刘李 何吉兰 马小珍 曹冉冉 黄玉兰

610041 成都，四川省疾病预防控制中心



·论著·

2015年四川省风疹病毒分离株的基因特征分析

刘李 何吉兰 马小珍 曹冉冉 黄玉兰

610041 成都，四川省疾病预防控制中心

目的 了解2015年四川省风疹病毒的基因特征。方法 采用Vero/SLAM细胞分离培养风疹病毒，通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法扩增风疹病毒E1基因编码的739个核苷酸片段，并对扩增产物进行序列测定和分析。结果 19株风疹病毒分离株均属于2B基因型，分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99%-100%和97.9%-100%，重要位点未发生变异。结论 2015年四川省流行的风疹病毒为2B基因型。

风疹是由风疹病毒(Rubella Virus, RV)引起的以发热和出疹为主要临床症状的急性呼吸道传染病，可通过呼吸道以及直接接触进行传播。一般感染后临床症状较轻，并发症少，但如果妊娠早期感染风疹病毒，可引起胎儿流产、死亡或婴儿出生后出现以多器官严重损伤为主要表现的先天性风疹综合症(Congenital rubella syndrome, CRS)[1]。

RV是披膜病毒科风疹病毒属(Rubivirus)的唯一成员，为有包膜的单股正链核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA)病毒，只有1个血清型，但有多个基因型。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将E1基因的739个核苷酸作为RV基因型划分和常规分子流行病学研究的标准靶核苷酸序列，目前分为12个可识别基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B和2C)和1个临时基因型(1A)，其中1E和2B是分布最广的两种基因型[2,3]。

四川省于2006年首次分离到RV[4]，并在此基础上逐渐建立了我省风疹病毒数据库。2015年各市州监测到多起疑似风疹散发病例，并对获得的RV进行了基因特征分析。

1 材料与方法

1.1 标本的采集和处理 各市(区、县)疾病预防控制中心采集疑似风疹患者(出疹5 d内)咽拭子，标本保存在病毒标本运输液中，-20 ℃或以下温度保存，冷冻运输。标本用终浓度各为1 000 U/ml的青霉素和1 000 μg/ml的链霉素处理后，置4 ℃保存备用。

1.2 病毒分离培养 将处理后的咽拭子标本接种于在培养管中生长良好的Vero/SLAM单层细胞上，置5% CO2培养箱，36 ℃连续培养7 d，逐日观察pH值变化和细胞病变(Cytopathic effect, CPE)[5]。由于RV不能使细胞发生明显的CPE，因此盲传三代。Vero/SLAM细胞由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹风疹实验室提供。

1.3 风疹病毒RNA提取和鉴定 采用Promega公司的 Maxwell® 16 Viral Total Nucleic Acid Purifi-cation Kit，用Maxwell® 16 Instrument(Magnetic Particle Processor AS2000)按试剂盒说明书提取病毒RNA，-20 ℃保存备用。使用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RV的核酸。

1.4 RT-PCR 将RV核酸阳性标本的RNA采用Qiagen公司OneStep RT-PCR Kit进行逆转录反应。分别扩增RV E1基因的479个核苷酸片段(8633F-9112R)和633个核苷酸片段(8945F-9577R)，反应条件为50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 核苷酸序列测定和分析 扩增产物在毛细管电泳上鉴定后用Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)按说明书进行纯化。纯化产物经标记反应后在ABI 3500xl DNA 测序仪上自动完成序列测定。分别使用BioEdit 7.0和MEGA 6.0软件对我省分离到的19株毒株El基因编码的739个核苷酸(8 731-9 469nt)与WHO公布的32个基因型参考株进行基因亲缘性关系树的构建以及核苷酸和氨基酸序列的同源性分析(Kimura 2 参数模型，邻位-连接法，1 000次bootstrap检验)。

2 结果

2.1 病毒分离和鉴定 2015年共收到34份疑似风疹病例咽拭子标本，接种到Vero/SLAM细胞上未见明显CPE；经实时荧光定量RT-PCR鉴定，共分离到19株RV，病毒分离率为55.88%，其中成都9株(2015-906与2015-908为同一个病例，在以下的数据分析中均作为1株计算)、自贡4株、南充3株、广安2株、内江1株(表1)。

2.2 基因亲缘性关系分析 用BioEdit7.0和MEGA6.0软件对分离到的19株RV与32株WHO参考毒株基于E1基因739个核苷酸序列构建基因亲缘性关系树，结果显示，2015年四川省的19株RV与 WHO参考株(RVi-Washington.USA-16.00-2B)形成一个分支，属于2B基因型，bootstrap值为73%(图1)。

表1 2015年四川省19株RV相关信息表

将2015年四川省分离的RV与GenBank中下载的中国其他15个省和WHO的3株2B基因型参考株构建基因亲缘性关系树，结果显示，我省2015年的RV跟其他省不同年代份分离株交织在一起(图2)。

图1 2015年四川RV与WHO参考株E1基因739个核苷酸的亲缘关系树Fig.1 Phylogenetic tree of Sichuan RV isolates in 2015 compared to WHO reference strains based on E1 739 nucleotides

2.3 核苷酸序列分析 18株RV(2015-906与2015-908为同一个病例，在以下的数据分析中均作为1株计算)之间的核苷酸序列同源性为99%-100%，其中2015-189、190与191；630与740；865与866；906、911、1022、1023与1025的核苷酸序列完全一致。与该基因型WHO参考株(RVi-TelAviv.ISR-0.68-2B、RVi-Anhui.CHN-0.00-2-2B、RVi-Washington.USA-16.00-2B)的核苷酸序列同源性为94.8%-97.6%，比对各分离株与参考株E1基因的739个核苷酸，共有8个核苷酸位点发生整体变异，还有11个位点的变异在个别分离株零星发生的。

▲四川省2015年风疹病毒分离株；△中国部分省市2B基因型分离株；○ WHO 2B基因型参考株；● 2006年四川省首次分离到的2B基因型分离株图2 2015年四川省RV与中国其他省份RV 2B分离株E1基因739个核苷酸亲缘关系树▲ RV strains of Sichuan in 2015;△ RV 2B strains of other provinces in China;○ RV 2B reference strains of WHO;● RV 2B strains isolated of Sichuan in 2006 2BFig.2 Phylogenetic tree of Sichuan RV isolates in 2015 compared to 2B strains of other provinces based on E1 739 nucleotides

2.4 氨基酸序列分析 18株RV之间的氨基酸同源性为97.9%-100%，与该基因型WHO参考株(RVi-TelAviv.ISR-0.68-2B、RVi-Anhui.CHN-0.00-2-2B、RVi-Washington.USA-16.00-2B)的氨基酸同源性为83.9%-95%。比对各分离株与参考株基于 E1基因 739 核苷酸推导的氨基酸序列(aa159-404)，氨基酸序列高度保守，只有少数几个位点存在氨基酸的变异。其中2015-1024株的aa244位点 由精氨酸变异为谷氨酰胺，2015-1005株的aa257位点由亮氨酸变异为苯丙氨酸，2015-1006株的aa327位点由赖氨酸变异为精氨酸，2015-543株的aa337位点由丙氨酸变异为苏氨酸。

3 讨论

RV于1962年首次分离成功，为有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长9 762 bp，含有2个不重叠的开放读码框架和3种主要的结构蛋白C、E2和El。其中E1糖蛋白基因全长1 443 bp，有3个潜在的N-型糖基化位点，具有重要的中和抗原决定簇和血凝抑制活性[6]。许文波等[7]于1999年起开展了我国RV的分子流行病学研究，初步建立了RV毒株库和基因数据库。

我国自1999年以来开展风疹病毒学监测，2004年将风疹纳入中国疾病监测信息报告管理系统，按丙类传染病进行管理[8]。我省虽未开展系统的风疹和CRS的监测，但随着麻疹消除的临近，已将风疹的实验室检测逐步整合到麻疹监测中去。通过连续的风疹病毒学监测发现，RV的流行模式在不断地发生改变。2001-2011年，1E基因型替代1F基因型成为我国优势流行基因型，而2B基因型只有零星检测到；从2011年起，2B基因型在全国逐渐蔓延，成为我国近两年的绝对优势流行基因型[9-14]。我省RV的流行情况与全国类似，在06年首次分离到输入性风疹病例2B基因型，随后陆续分离到1E基因型，成为我省优势流行基因型；2013年1E和2B两种基因型交互流行，从2014年至今只分离到2B基因型，逐渐取代1E基因型成为了我省RV的优势基因型。

2015年我省分离的RV之间的核苷酸同源性为99%-100%，不同地市州检测到相同的RV，可能有来自同一传播链的RV在持续传播；而同一地区内的分离株分处于不同的小分支内，说明同一地区存在不同的RV传播链。从我省与我国其他地区流行株的亲缘关系来看，我国近几年2B型RV呈交叉循环流行，无明显的时间和地域差异。单从时间上看，与近年来(2011-2015年)的病毒株比较靠近，而与06、08年的病毒分离株较为疏远，分属于不同的小分支上。我省分离的RV之间的氨基酸同源性为97.9%-100%，氨基酸序列高度保守，只有4个位点存在氨基酸的变异，N-型糖基化位点、血凝抑制位点和中和位点均未发生改变。

据现有的风疹监测数据分析，我国的风疹发病可能呈现7-8年的一个流行高峰[15]。2008年发病达到高峰，有可能2016年会出现一个流行高峰，所以做好风疹的监控尤为重要。本研究为以后四川省RV的分子流行病学研究打下了基础，通过对RV的基因特征分析，有助于了解病毒基因型的分布，追踪病毒的来源、传播途径和变异情况，以及有效地评价疫苗的免疫效果。目前我省的风疹病毒学监测还比较薄弱，需要进一步加强并扩大开展RV监测，建立完整的RV分子流行病学基线数据，为风疹和CRS的控制提供重要的科学依据。

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Genetic characteristics of rubella virus isolated in Sichuan province in 2015

LiuLi,HeJilan,MaXiaozhen,CaoRanran,HuangYulan

SichuanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Chengdu610041,China

HuangYulan,Email: 33599886@qq.com

Objective To understand the genetic characteristics of rubella virus in Sichuan province in 2015. Methods Vero/SLAM cells were used for rubella virus isolation and culture. The 739 nucleotides of E1 gene was amplified by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and subjected to sequence and homological analysis. Results 19 strains of rubella virus were isolated and identified as genotype 2B. The homology of nucleotides and amino acids were 99%-100% and 97.9%-100%, respectively. There were no changes in the important antigenic epitopes. Conclusions The rubella virus genotype circulated in Sichuan province in 2015 was genotype 2B.

Rubella virus; Sequence analysis; Genotype

黄玉兰，Email：33599886@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.003

风疹病毒属；序列分析；基因型

2016-04-12)