液相色谱荧光检测水产品中隐色孔雀石绿残留的方法

2016-11-16 11:51曹院章唐艳荣王艳红王丹怡詹颖洁
中国畜牧兽医文摘 2016年7期
关键词:孔雀石标尺标准溶液

郭 睿 曹院章 唐艳荣 王艳红 王丹怡 詹颖洁

(北京市朝阳区动物疫病预防控制中心,北京 100018)

液相色谱荧光检测水产品中隐色孔雀石绿残留的方法

郭 睿曹院章唐艳荣王艳红王丹怡詹颖洁

(北京市朝阳区动物疫病预防控制中心,北京100018)

本文概述了隐色孔雀石绿残留检测的液相色谱荧光检测方法,在实验过程中出现问题的查找步骤与实验设计,进一步解析了该实验操作,为实验室检测方法的实施与改进提供参考。

隐色孔雀石绿查找步骤实验设想

孔雀石绿(Basic Green 4)作为抗真菌剂,是抗外生性寄生虫药和消毒剂,被广泛使用于鱼类养殖业中。但是,研究显示,孔雀石绿具有三致作用,进入人类或动物机体后,可以通过生物转化,还原代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿,具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用,严重威胁人类身体健康,因此,孔雀石绿在水产养殖业中禁用。

1 实验设计

本实验室于2012年成功增项《GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》,自此该项目成为实验室重点监测项目,“两会”水产品特供保障项目。

自从2016年3月开始,该项目的检测谱图出现了明显的异常,每批次检测样品的质控样品回收率无法达标,而且谱图杂乱,噪音很高,检测结果无法保证准确度。该项目只能暂时拿下,查找原因,验证后,才能重新投入检测。

2 出现问题的原因分析

2.1 检测仪器

直接配制对照标准点,实验室平时验证标准溶液均使用10μg/kg浓度的隐色孔雀石绿。在现有仪器waters e2695+2475和waters 2695+2475上进行仪器比对,结果发现,两台仪器响应值均出现降低的现象。于是按照仪器清洗程序进行维护,分别用稀硝酸和异丙醇冲洗管路过夜,经过10μg/kg标准溶液比对,waters e2695+2475性能恢复,色谱峰响应值可以达到初始状态。waters 2695+2475系统老化,无法达到信号响应强度,提交申请向仪器厂家报修,仪器更改相应状态标识。详见图1。

图1 e2695+2475标准曲线

从图中可以看出,性能恢复的waters e2695+2475检测标准曲线,r2=0.999582,最低检出限为0.5μg/kg,可以确定检测仪器没有问题。

2.2检测试剂

重新领用未开封的实验涉及的试剂,仔细核对,重新配制相关溶液,注意每一个环节,严格操作。使用新配制的试剂重新进行质控实验,采集数据,计算空白样品添加回收率,结果发现实验结果仍旧异常。详见图2。

图2 自动标尺色谱图

此次试验操作规范,实验过程中未发生异常,可以确定检测试剂和实验方法没有问题。

2.3样品提取步骤

使用重新配制的溶液,注意每一个环节,规范操作,重新进行质控实验,提取的样液浓缩后不经过净化,直接溶解上机检测,采集数据,计算空白样品添加回收率,结果发现提取液中有隐色孔雀石绿残留检出,回收量在合格范围内。详见图3。

图3 自动标尺色谱图

此次试验使用的相关设备和玻璃器具均不会出现异常,可以确定样品提取过程没有问题。

2.4样品净化步骤

使用固相萃取装置,直接用10g/kg标准溶液(基质为乙腈)分别过酸性氧化铝柱和PRS柱,分别接取过柱液、淋洗液、洗脱液,直接上机检测,采集数据,结果发现隐色孔雀石绿在酸性氧化铝过柱液中几乎全部流出无保留,在过PRS柱后无法检测出隐色孔雀石绿。详见图4。

过酸性氧化铝柱的过柱液

图4 自动标尺色谱图

过PRS柱的洗脱液

图5 自动标尺色谱图

此次试验可以肯定是净化步骤出现问题。

(1)直接使用10g/kg标准溶液(基质为乙腈)过PRS柱后无法在过柱液、淋洗液、洗脱液中检测出,首先怀疑是PRS柱异常。现在使用的PRS柱是Agilent公司的,于是从其他实验室借来了VARIAN的PRS柱,使用固相萃取装置,直接用10g/kg标准溶液(基质为乙腈)分别过酸性氧化铝柱和PRS柱,分别接取过柱液、淋洗液、洗脱液,直接上机检测,采集数据,结果发现隐色孔雀石绿在Agilent PRS柱和VARIAN PRS柱的洗脱液中均无法检测出隐色孔雀石绿。详见图6。

过Agilent PRS柱的洗脱液

图6 自动标尺色谱图

过VARIAN PRS柱的洗脱液。

此次试验可以排除PRS柱的厂家差异,问题查找进入了瓶颈期。

(2)为了确定隐色孔雀石绿残留的去向,于是设计直接采用液相方法的PRS柱后过柱液、淋洗液、洗脱液上液相色谱串联质谱检测器,确定是否含有隐色孔雀石绿,结果发现隐色孔雀石绿就残留在洗脱液中。详见图8。

图8 自动标尺色谱图

此次试验可以确定是净化步骤的洗脱出现问题。

(3)洗脱过程排除了试剂问题、固相萃取柱问题、实验方法问题,还会涉及的只有固相萃取装置,于是直接使用10g/kg标准溶液(基质为乙腈)自然过PRS柱,过柱过程中只会采用吸耳球手工吹打,收集柱后过柱液、淋洗液、洗脱液,上机检测,采集数据,结果发现洗脱液中隐色孔雀石绿几乎全部洗脱无保留,色谱峰峰型良好。详见图9。

图9 自动标尺色谱图

此次试验可以确定是固相萃取装置管路年久老化,在洗脱过程中溶解了杂质,造成色谱图基线响应值过高,掩盖了目标峰的信号。

3 结语

通过此次实验事故问题的查找步骤,更加系统地学习了《GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》,增长了经验,也深切体会了日常仪器设备的维护和自检的重要性。希望通过我实验室的这次常规检测项目问题查找步骤,可以给同行们的工作一些参考建议。实验室技能的日益提高,不排除会出现各种各样的问题,检测工作的严谨性要求我们面对任何异常不得不求甚解,问题的出现是我们提高技术的契机。

图7 自动标尺色谱图

郭睿(1981-),职称:中级兽医师,研究方向:实验室管理及检测。

曹院章(1966-),职称:中级兽医师,研究方向:检疫及兽药残留检测。

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