不同产地栽培掌叶大黄中游离蒽醌、结合蒽醌和总蒽醌量的差异分析

杨　敏，潘兴娇，江　静，姚玉婷，赵　洋，周　浓，*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆404000）

不同产地栽培掌叶大黄中游离蒽醌、结合蒽醌和总蒽醌量的差异分析

杨敏1，潘兴娇1，江静2，姚玉婷2，赵洋2，周浓1，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆404000）

目的：测定不同产地的栽培掌叶大黄药材中游离蒽醌、总蒽醌及结合蒽醌的含量，为其药材质量评价和资源合理利用提供科学依据。方法：采用Agela Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35℃，对11批掌叶大黄药材进行测定，并对测定结果进行聚类分析。结果：不同产地的栽培掌叶大黄均含有5种蒽醌类衍生物，甘肃礼县上坪质量最优。采用聚类分析能将不同产地的11批掌叶大黄药材分为3类。结论：本实验考察了不同产地掌叶大黄的质量差异，可为大理苍山地区掌叶大黄的质量评价及规范化种植提供参考。

掌叶大黄；不同产地；蒽醌；高效液相色谱法；含量测定；聚类分析

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.003

大黄始载于《神农本草经》，是我国的四大中药之一，应用历史悠久，是一味泻热毒、荡积滞、行瘀血的良药。大黄含有蒽醌类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等化学成分，其中蒽醌类化合物为其质量指标成分，包括具有抑菌作用的游离蒽醌（如大黄酚、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚等）以及具有泻下作用的结合蒽醌（如双蒽酮苷和单糖苷）〔1〕。

大黄是多种蓼科大黄属的多年生植物的合称，为多基原药材，《中国药典》（2015版）〔2〕规定药材大黄应来自掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎。已有文献报道掌叶大黄和唐古特大黄质量较好，药用大黄质量较差〔3-4〕。而产地不同，大黄的质量差异也较大。甘肃礼县是掌叶大黄的传统道地产区，种植历史悠久，其中以铨水乡一带出产的大黄最负盛名，简称“铨黄”。礼县大黄的主产区为8个乡∶沙金、白关、白河、铨水、桥头、草坪、上坪、洮坪。目前，大理苍山地区也在种植掌叶大黄，大理市花甸坝地方国营药材场种植掌叶大黄面积已达数千亩〔5〕。礼县大黄多生于海拔2 000 m左右排水良好的高山坡地，而大理市花甸坝坐落在苍山十九峰中最北的云弄、沧浪两峰之间，海拔2 900 m，坝内溪水汇集，以种植药材和养殖牲畜为主。本试验采用HPLC法，对11批不同产地的礼县大黄和大理产掌叶大黄中游离蒽醌、结合蒽醌和总蒽醌的含量进行测定，并对测定结果进行聚类分析，为大理苍山地区掌叶大黄的质量评价及规范化种植提供参考。

1　仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；KH-300GTDV型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；R-300型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；AE240型天平（德国Mettler Toledo公司）。

芦荟大黄素对照品（纯度≥98%，批号110795-200806）、大黄酸对照品（纯度≥98%，批号110757-200206）、大黄素对照品（纯度≥98%，批号110756-200110）、大黄酚对照品（纯度≥98%，批号110796-201017）、大黄素甲醚对照品（纯度≥98%，批号110758-200912）、对照药材（批号121249-201003）均购自中国食品药品检定研究院，甲醇为色谱纯、水为娃哈哈牌纯净水、其他试剂均为国产分析纯。

2010年7月从甘肃礼县各乡收集8批掌叶大黄药材，2010年9月从云南大理花甸坝药材种植基地收集3批掌叶大黄药材。经重庆三峡学院周浓副教授鉴定，11批药材均为掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根和根茎。

2　方法与结果

2.1色谱条件流动相∶甲醇-0.1%磷酸溶液（75%-25%）；流速∶1.0 mL/min；色谱柱∶Agela Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温∶35℃；波长∶254 nm；进样量∶20 μL。对照品和供试品的色谱图见图1。并对方法学（线性关系、精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验）进行了考察，结果均符合分析要求〔6〕。

图1　对照品及样品的HPLC图

2.2对照品溶液制备精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，置于容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成浓度为含芦荟大黄素2.185μg/mL、大黄酸0.770μg/mL、大黄素0.986μg/mL、大黄酚2.028 μg/mL、大黄素甲醚0.515 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

2.3.1游离蒽醌供试品溶液取掌叶大黄样品各粉末（过四号筛）约0.20 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇35 mL，室温浸泡2 h，密塞，超声30 min，过滤，重复1次，合并提取液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，即得。

2.3.2总蒽醌供试品溶液精密量取“2.3.1项”滤液2 mL，置100 mL烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液15 mL，超声处理10 min，再加三氯甲烷15 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇置水浴中微热溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4线性关系考察精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL进样，得回归方程为Y=5 402.5X-5.376 5（芦荟大黄素，r=0.999 9）；Y=2 363X-1.047 3（大黄酸，r=0.999 9）；Y=3 178.8X+2.741 6（大黄素，r= 0.999 8）；Y=5 031X+9.126 2（大黄酚，r=0.999 9）；Y=1 676.1X-2.339 6（大黄素甲醚，r=0.999 6）。结果表明，芦荟大黄素在0.002 5～1.000 0 μg、大黄酸在0.002 5～1.000 0 μg、大黄素在0.003 0～1.200 0 μg、大黄酚在0.0060～2.4000μg、大黄素甲醚在0.0030～1.200 0 μg范围内呈良好线性关系。

2.5精密度试验取对照品溶液，连续进样6次，计算，RSD≤0.27%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验取同一掌叶大黄样品6份，制备游离蒽醌和总蒽醌供试品溶液，进样测定，供试品溶液中5种蒽醌衍生物的RSD≤2.95%，表明本方法重复性良好。

2.7稳定性试验取同一掌叶大黄样品，制备游离蒽醌和总蒽醌供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定，供试品溶液中5种蒽醌衍生物的RSD≤2.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验精密称取已知含量的掌叶大黄样品，每份约0.10 g，分别精密加入一定量的5种蒽醌衍生物对照品，制备游离蒽醌和总蒽醌供试品溶液各9份，进样测定，游离蒽醌供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率为96.23%、106.96%、95.29%、96.29%、95.44%，RSD≤2.24%；总蒽醌供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率为101.24%、98.94%、96.37%、98.97%、97.76%，RSD≤2.55%。

2.9样品测定按“2.1”色谱条件和“2.3”供试品溶液的制备方法对11批不同产地的掌叶大黄和对照药材进行含量测定，含游离蒽醌以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量计，含总蒽醌以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量计，用总蒽醌量与游离蒽醌量的差值，作为结合蒽醌的量。见表1。

表1　不同产地掌叶大黄中蒽醌含量的比较（mg/g，n=3）

各种游离蒽醌（游离芦荟大黄素、游离大黄酸、游离大黄素、游离大黄酚、游离大黄素甲醚）均在产地S8含量最高，且均显著高于其它地区（P＜0.05）。游离芦荟大黄素在产地S1、S3、S7和对照药材S12中量含相对较少，但几者之间差异无统计学意义。游离大黄酸、游离大黄酚以及游离蒽醌总量在产地S7含量最低，且显著低于其它地区（P＜0.05）。游离大黄素和游离大黄素甲醚在对照药材S12含量最低，且显著低于其他地区（P＜0.05）。结合芦荟大黄素在产地S4和S7含量稍低，但两者间差异无统计学意义。他在产地S9含量最高，显著高于其它地区（P＜0.05）。结合大黄酸在产地S4含量最低，在对照药材S12含量最高，与其他地区差异具有统计学意义（P＜0.05）。结合大黄素在产地S7和对照药材S12含量稍低，但两者间差异无统计学意义。它在产地S8含量最高，显著高于其他地区（P＜0.05）。结合大黄酚在产地S7含量最低，在产地S8含量最高，与其他地区差异具有统计学意义（P＜0.05）。结合大黄素甲醚在产地S2含量最低，显著低于其他地区（P＜0.05），它在产地S9和S10含量稍高，但两者间差异无统计学意义。结合蒽醌总量在产地S2和S7含量稍低，在产地S9和S10含量稍高，但各两者间差异无统计学意义。总蒽醌在产地S7含量最低，在产地S8含量最高，与其他地区差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.10聚类分析分别取11批不同产地的掌叶大黄和对照药材中的蒽醌含量测定结果进行聚类分析。利用SPSS19.0版本软件欧式距离平方（squared Euclidean distance）计算样品间的相似系数，并用离差平方和法（Ward法）进行系统聚类。见图2。

图2　不同产地掌叶大黄中蒽醌类含量聚类分析树状图

由图2可见，当分类距离为10时，可将11批不同产地的掌叶大黄和对照药材分为3类∶第一类有3批药材，即S9、S10、对照药材S12，此类样品中游离芦荟大黄素高于平均值，游离蒽醌总含量均低于平均值，结合蒽醌、总蒽醌含量均高于平均值；第二类有8批药材，即S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S11，此类药材中被测成分及总蒽醌量均远低于平均值；第三类有1批药材，即S8，此类药材中被测成分及总蒽醌含量均远高于平均值。见表2。

3　讨论

从实验结果看，甘肃礼县上坪乡的掌叶大黄（S8）质量最优。这与铨水乡大黄品质最好的记载不一致，可能是由于不同产地掌叶大黄的生长地域、采集时间、贮存条件不同引起次生代谢成分组成和含量的变化〔7-10〕。

《中国药典》（2015版）大黄含量测定项下规定，总蒽醌含量不得少于1.5%、游离蒽醌含量不得少于0.20%。根据聚类分析的结果，第一类大理市花甸坝药材场1队（S9）、大理市花甸坝药材场2队（S10）、对照药材（S12）和第三类甘肃礼县上坪（S8）批次符合药典规定，可为大理苍山地区掌叶大黄的质量评价及规范化种植提供参考。

表2　不同产地掌叶大黄中蒽醌类成分含量聚类分析的不同组别各组分的平均含量（mg/g，n=3）

〔1〕程小丽，魏胜利，刘春生，等.RP-HPLC-DAD同时测定大黄中9种有效成分的含量〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：99-102.

〔2〕国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知：中药饮片卷〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2011.

〔3〕杜清涛，温金莲，严优芍，等.不同品种不同产地大黄UPLC指纹图谱研究〔J〕.中药材，2013，36（5）：725-731.

〔4〕李芸，苗小楼，吴平安，等.大黄不同品种不同产地加工品的蒽醌含量比较〔J〕.药物分析杂志，2012，32（12）：2257-2261.

〔5〕杨颖，杨晓莉，周平，等.大理花甸坝药材场五种药材中重金属含量的测定〔J〕.大理学院学报，2010，9（6）：10-13.

〔6〕邹亮，周浓，谢静，等.栽培药用大黄不同部位中5种蒽醌类衍生物的含量分析〔J〕.广东农业科学，2012，39（18）：118-122.

〔7〕周利，陈桂琛，史萍.一年和二年生人工种植唐古特大黄蒽醌类成分的变化〔J〕.中成药，2011，33（2）：297-300.

〔8〕代婉莹，孙维宏，毛淑杰，等.铨水大黄外观性状与所含5种蒽醌成分含量的关系〔J〕.中国实验方剂学杂志，2009，15（9）：1-4.

〔9〕李磊，孙平，冯成强.不同产地野生与栽培掌叶大黄中蒽醌类成分含量的比较〔J〕.时珍国医国药，2010，21（9）：2251-2253.

〔10〕周浓，王光志，刘文燕.栽培掌叶大黄不同部位中蒽醌类衍生物的含量分析〔J〕.中药新药与临床药理，2012，23（6）：670-675.

Difference Analysis of Free Anthraquinones，Combined Anthraquinones and Total Anthraquinones in Cultivated Rheum palmatum L.in Different Producing Areas

Yang Min1，Pan Xingjiao1，Jiang Jing2，Yao Yuting2，Zhao Yang2，Zhou Nong1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China）

Objective:To determine content of free anthraquinones，combined anthraquinones and total anthraquinones in cultivated Rheum palmatum L.in different producing areas，and to provide scientific basis for quality assessment and reasonable using.Methods: Agela Venusil XBP-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used with the mobile phase of methanol-0.1%posphoric acid solution（75∶25）at the flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 35℃.To determine the content of cultivated Rheum palmatum L.from 11 different producing areas，cluster analysis was carried out for the results.Results:5 kinds of anthraquinons exist in cultivated Rheum palmatum L.from different producing areas，in which cultivated Rheum palmatum L.from Lixian，Gangsu was the best.Cluster analysis divided cultivated Rheum palmatum L.from 11 different producing areas into 3 categories.Conclusion:This paper analyzes the quality of cultivated Rheum palmatum L.from different producing areas，it could provide reference for quality assessment and standardized planting of cultivated Rheum palmatum L.in Dali.

Rheum palmatum L.；different producing areas；anthraquinons；HLPC；determination；cluster analysis

R917

A

2096-2266（2016）10-0009-05

（责任编辑李杨）

国家自然科学基金资助项目（81260622）；重庆三峡学院大学生创新创业训练计划资助项目（2014040）

2016-05-11

2016-06-06

杨敏，讲师，主要从事药物分析教学研究.

*通信作者：周浓，副教授.