萝卜离体再生体系的建立

黄俊豪　徐文玲　刘贤娴　刘辰　王淑芬　杨建平

摘要：以8种不同基因型的萝卜为试验材料进行带柄子叶离体培养，筛选诱导不定芽和不定根的最佳培养基配方。结果表明：喜诺晓青和翠绿萝卜具有高频再生潜力，由其带柄子叶诱导不定芽的最佳培养基为：Ms培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，诱导不定根的最佳培养基为：Ms培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。

关键词：萝卜；愈伤组织；不定芽；不定根；激素

中图分类号：S631.104⁺.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0021-03

萝卜（Raphanus sativus L.）又名莱菔，是十字花科萝卜属的二年生草本植物。作为一种以肉质根为主要食用部位的蔬菜作物，萝卜深受广大群众喜爱，在我国南北各地普遍栽培。随着生活水平的提高，人们对萝卜品质的要求也日益增长，这就对尽快育成优质抗病的萝卜新品种提出了迫切要求。建立高效的离体再生体系是亲本无性快繁和基因工程育种的基础环节，然而萝卜一直以来被认为是一种再生顽拗型植物，再生难度大、广泛适应性不强。本试验选用不同基因型萝卜为材料，从培育无菌苗到诱导愈伤组织、不定芽、不定根，再到最后炼苗移栽，拟建立起完整的具有广泛适应性的萝卜离体再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿萝卜8个萝卜品种。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗培育 将萝卜种子于超净工作台上用75%酒精处理30s，再用4%次氯酸钠溶液灭菌3min，最后用蒸馏水冲洗3遍，接种于1/2MS培养基上，室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养，得到无菌苗。

1.2.2 愈伤组织和不定芽的诱导 取生长3～5d的无菌苗，切取子叶，留叶柄并将生长点去除干净，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养15～20d，统计愈伤组织和不定芽的诱导率。通过记录每种培养基内萝卜带柄子叶的再生情况，确定适宜的愈伤组织和不定芽诱导激素配比和诱导天数。

1.2.3 不定根的诱导 取诱导出的不定芽，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养15～20d，统计不定根诱导率。通过记录每种培养基内不定芽的生根情况，确定适宜的不定根诱导激素配比和诱导天数。

1.2.4 炼苗移栽 将不定根诱导成功的再生植株培养瓶的盖子揭开，注意适当保湿，使再生苗的生长环境接近于田间，进行炼苗培养。2～3d后将再生苗移栽于营养钵中，于炼苗室内缓苗培养15d左右，再移栽到大田中。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导培养基的筛选

以MS培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+不同配比激素，在pH5.7左右诱导萝卜带柄子叶再生愈伤组织效果明显，8个萝卜品种分别经由2，4-D、IBA和NAA配合6-BA均能诱导出愈伤，其中，2，4-D配合6-BA诱导愈伤组织的效果最佳（表1）。

虽然8个萝卜品种的带柄子叶均诱导形成了愈伤组织，但是愈伤进一步分化形成不定芽却极其困难。在各种激素的诱导下，愈伤组织极易先生根，却难以诱导出芽，仅喜诺晓青和翠绿萝卜在NAA配合6-BA诱导培养基中不仅再生出了愈伤组织，还再生出了不定芽，但诱导率却很低。

2.2 不定芽诱导培养基的进一步筛选

以喜诺晓青和翠绿萝卜为试材，进一步细化NAA和6-BA激素配比进行不定芽的诱导。发现随激素浓度的增加，萝卜不定芽诱导率有先增加后降低的趋势（表2）。6-BA和NAA浓度比值为100时，不定芽的诱导率较高，比值过高或过低会导致不定芽的诱导率下降。综合比较，5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定芽较适宜。翠绿的不定芽诱导率明显高于喜诺晓青，说明翠绿的基因型易再生培养。

2.3 不定根诱导培养基的筛选

在诱导不定芽的基础上，进一步试验不同浓度6-BA与NAA配比对喜诺晓青和翠绿萝卜不定根再生的影响，发现不定根的诱导与NAA浓度密切相关，NAA浓度过低时无法生成不定根，而NAA浓度过高时，生根率也会降低。总体来看，以5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定根比较适宜（表3）。翠绿比喜诺晓青更易于再生出不定根，说明易于诱导出不定芽的基因型也同样适宜进一步诱导不定根，萝卜的再生频率高低和其基因型密切相关。

3 结论与讨论

植物组织培养过程中，不定芽有通过外植体直接诱导出芽和经愈伤组织诱导出芽两种途径，2，4-D、IBA和NAA配合6-BA诱导愈伤组织、再经愈伤组织诱导出芽在番茄、黄瓜等蔬菜作物中均有报道。关于萝卜的离体培养，仅有诱导出愈伤组织和直接诱导出不定芽的报道，并没有从愈伤组织再诱导出芽的报道，所以，萝卜离体再生诱导的关键是直接诱导不定芽的分化和增殖。

本试验选用潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿共8份试验材料，多数材料仅能再生出愈伤组织，难以进一步分化再生出不定芽，其中仅有喜诺晓青和翠绿萝卜诱导出了不定芽并进而形成不定根。说明萝卜的再生能力较弱，其再生能力在不同基因型间差异十分显著。

外植体的选择也是影响萝卜再生诱导效果的关键因素之一。本试验初期选用了下胚轴、子叶、子叶横切、子叶纵切和带柄子叶这几种外植体材料，其中再生效果最差的是下胚轴，效果最好的是带柄子叶，所以后期试验都采用带柄子叶作为外植体。本研究发现萝卜带柄子叶离体培养的再生方式相对特殊，在不定芽诱导过程中先是子叶叶柄基部膨大产生少量愈伤组织后再生成大量不定芽，若外植体接种后产生大量愈伤组织就不能有效产生不定芽，说明诱导愈伤组织的多少对不定芽再生有重要影响，这可能与其再生顽拗有所关联，关于产生愈伤组织的多少对于有效诱导不定芽的影响机制有待进一步深入研究。

生长激素的配比也是植物再生至关重要的因素，不同的植物对生长激素有不同的要求。本试验在MS培养基中分别添加2，4-D、IBA、NAA和6-BA，最终发现仅有NAA配合6-BA能够直接诱导萝卜带柄子叶生成不定芽和不定根。通过多组试验，确定其诱导不定芽的最佳培养基为MS培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，诱导不定根的最佳培养基为MS培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。