性别鉴定中amelogenin基因座变异的研究进展

黄江平，杨帆，刘亚楠，邹凯南，曹禹，吴丹，陈荣华，平原，周怀谷

（上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海　200083）

·经验交流·

性别鉴定中amelogenin基因座变异的研究进展

黄江平，杨帆，刘亚楠，邹凯南，曹禹，吴丹，陈荣华，平原，周怀谷

（上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海200083）

Amelogenin基因座变异，分为amelogenin引物结合区突变和包含amelogenin基因座的Y染色体微缺失两种类型，以后者最为常见。Amelogenin引物结合区突变的发生机制是核苷酸点突变，包含amelogenin的Y染色体微缺失的发生机制可能是非等位同源重组或者非同源末端连接。在全世界人群中，位于印度次大陆地区的印度人群、斯里兰卡人群和尼泊尔人群amelogenin变异率非常高。Amelogenin变异对生育能力和表型影响非常小，但在性别鉴定中会导致错误的性别鉴定结果。采用包含常染色体STR基因座、amelogenin基因座和多个Y-STR基因座的复合扩增试剂盒进行检测可有效避免因amelogenin变异导致的性别误判。

法医遗传学；amelogenin；综述；性别鉴定；变异

通过amelogenin基因座分型进行性别鉴定可广泛应用于法医物证检验［1］，非整倍型性染色体畸变诊断［2］、考古分析［3］、产前诊断［4］、DNA数据库、血液样本储存等。Amelogenin是编码牙釉蛋白的基因，单拷贝，序列在灵长类高度保守。Amel-X和Amel-Y是amelogenin基因座的一对等位基因，分别位于Xp22.1-Xp22.3（2872bp）和Yp11.2（3272bp）［5-7］。通过设计引物，覆盖X或者Y染色体内含子或者外显子内不同的缺失，可得到长度不同的X和Y的PCR产物，利用长度差异进行性别鉴定［8］。目前最常使用的特异性PCR引物是由英国法庭科学服务部（Forensic Science Service，FSS）设计的，这些引物可连接位于Amel-X内含子1内6 bp缺失的侧翼，同时PCR扩增X和Y染色体可获得106bp和112bp的产物［9］。

在法医物证检验中，性别鉴定结果的准确性尤为重要，可为侦查提供正确的方向，反之，则会使侦查走向歧途。然而，许多文献［10-32］报道了不同人群amelogenin基因座发生变异、导致X或Y染色体特异性基因座扩增失败的情形。为了避免在法医物证检验工作中发生性别误判，本文主要从amelogenin变异的概况、缺失定位、发生机制、变异后的影响以及应对amelogenin变异的策略进行综述。

1　Amelogenin变异概述

Amelogenin变异分为X和Y染色体amelogenin引物结合区突变和包含amelogenin基因座的Y染色体微缺失两类，前者非常少见，后者较为多见。1998年，Santos等［10］首次报道了amelogenin变异的案例，作者对来自全球不同国家的350个男性样本的Y染色体基因座进行检测，发现有两名斯里兰卡男性Amel-Y和Y染色体短臂上的多个Y基因座未检出，重新设计引物后Amel-Y仍未检出，排除了因Amel-Y引物结合区突变导致扩增失败，从而推断性别分型“错误”的原因是Y染色体短臂上包含amelogenin的片段发生缺失。由于样本量较少（24例），因而在法医界并没有引起很大的反响。随后Roffey等［11］和Henke等［12］相继报道了澳大利亚一个非本土的男性和一例亲子鉴定中的摩洛哥父子也发生了相似的性别分型“错误”，他们认为是Amel-Y引物结合区域发生突变而不是Amel-Y片段缺失，因为三种常用的引物共享至少5bp的引物结合区域，若点突变发生在这些重叠区域，同样会导致Amel-Y扩增失败。随着amelogenin广泛应用于性别鉴定，全世界不同人群amelogenin变异的报道越来越多，研究也越来越深入。大量的实验数据表明，包含amelogenin的Y染色体微缺失是amelogenin变异的主要类型（见表1）。有趣的是，观察到的amelogenin变异个体都是男性，理论上，amelogenin的变异率在男性和女性的X染色体中的比例是接近的，但由于女性有两条X染色体，仅一条X染色体发生变异时，另一条X染色体仍可指示性别，检验结果与表型不矛盾，而两条X染色体同时发生突变的概率非常低，所以目前还没有女性样本amelogenin变异的报道［13］。

Amelogenin的变异率具有人群特异性（表1），amelogenin的变异率在白人人群中普遍较低，在斯里兰卡人群、印度人群、尼泊尔人群非常高。大部分包含amelogenin的Y染色体微缺失属于Mark A.Jobling的Ⅰ型，缺失长度为3.0～3.8Mb［15］。Ⅰ型中属于单倍群J2e1的男性占相当高的比例，J2e1在土耳其人群中占0.96%，印度人群占5.22%，巴基斯坦人群占2.27%，尼泊尔加德满都人群占6.49%，尼泊尔尼瓦尔人群占1.5%，这些分布表明J2e1可能起源于印度次大陆内或者印度次大陆附近［14］。所以，包含amelogenin的Y染色体微缺失主要发生在印度次大陆地区的一个主要家系，并向外不断传播，同时世界其他地方的人群中也偶发了这种相似的变异。印度次大陆地区Amel-Y缺失频率相对较高可能是遗传漂变的结果［15-16］。

表1　全世界不同人群amelogenin变异率

2　Amelogenin缺失定位

2.1 Yp11.2区域概述

Amelogenin位于Yp11.2，Yp11.2包含5个单拷贝编码基因（TGIF2LY、PCDH11Y、Amel-Y、TBL1Y和PRKY），一对反向重复序列IR3和1个蛋白编码基因家族TSPY序列［34］。IR3反向重复序列对核苷酸一致性达99.75%，近端IR3重复序列和远端IR3重复序列间隔3.6Mb且方向相反。在群体内，IR3之间的DNA序列存在着倒位多态性［35］。TSPY序列长约700kb，以20.4kb的重复单位为基础，1个拷贝的重复单位包括1个TSPY基因和1个CYorf16转录单位，TSPY主要编码睾丸特异蛋白，CYorf16编码蛋白的潜质有待进一步发现［34］。TSPY序列包括位于近端的主要序列TSPYA和远端的次要序列TSPYB。TSPYA是一个高度规则的包含多个重复单位的串联排列序列，序列内一致性差异很少超过1%。TSPYB嵌入在远端IR3反向重复序列内的远端，只包含一个单拷贝的重复单位，序列内一致性偏离3%［34］。TSPY拷贝数在人群中有变异，在两个主要的研究中分别是18～47和23～64，这种变化可能由不等性姐妹染色单体互换引起［36］。

2.2 Amelogenin缺失的检测

2005年，Lattanzi等［27］首先采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridisation，FISH）对Amel-Y缺失进行初步定位，再用一系列STS进行精确定位，发现Amel-Y阴性的2例男性样本Y染色体短臂上存在跨度约2.5Mb的大片段缺失，2例样本的断点相同，近端断点位于TSPYA内，远端断点位于SY1242（6.444Mb）上游11538bp内的区域。

2006年，Jobling等［15］收集了来自全球12类人群的45例Amel-Y缺失的男性样本进行缺失定位，其中32个样本已经被报道过，但只是采用Y-STR基因座进行粗略定位。由于样本不满足荧光原位杂交技术的实验条件，作者选用了位于Y染色体短臂上的33个STS进行定位，结果显示，45例样本片段缺失位置明显不同，可分为五类（Ⅰ～Ⅳ型），Ⅰ型最为常见，包含38例，Ⅰ-S型包含3例，Ⅱ型包括2例，Ⅲ和Ⅳ型各1例。Ⅰ型和Ⅰ-S型的远端断点位于SY1241（6.146Mb）和SY1242（6.444Mb）之间，这段298kb的区域恰好是远端反向重复序列IR3的位置，进一步确定断点不切实际，因为IR3反向重复序列对一致性达99.75%，无法设计STS。近端断点位于SY1079（9.199Mb）和SY59（9.969Mb）之间，即TSPYA（9.214～9.994Mb）序列内，TSPYA是串联排列序列，整个TSPY序列一致性达96%（远端的TSPYB序列考虑在内），所以也无法进一步设计STS。Ⅰ型和Ⅰ-S型的区别在于SY59是否存在，检测SY59周围的序列，显示SY59位于TSPYA最后一个和倒数第二个拷贝之间，但在来自全球的188个Amel-Y没有缺失的男性中发现了2例SY59不存在的情况，分别属于单倍群I和E（xE3b3），推测SY59的多态性是由于TSPYA末端重组引起的。Ⅰ-S型应归为Ⅰ型，Ⅰ型和Ⅰ-S型缺失片段长度为3.0～3.8 Mb；Ⅱ～Ⅳ型缺失的断点位置与Ⅰ型不同，缺失片段长度分别是3.5～3.9Mb、3.9～4.0Mb、2.5～3.1Mb。

2007年，Yong等［14］除了使用已知的STS进行低分辨率定位外，利用TSPY序列独一无二的特性同源序列变异（paralogous sequence variant，PSV），在TSPYA（9.214～9.994 Mb）和TSPYB（6.153～6.190 Mb）序列内分别设计了9个STS和27个STS进行高分辨率定位，但是由于TSPYA序列的高度重复性和序列内（9.285～9.885Mb）有约600kb的未知序列，所以近端断点位置仍无法精确判断。远端断点可以用STS清楚区分，不同样本TSPYB（6.153～6.190 Mb）序列内的断点不同，缺失长度与个体所属的单倍群有关，缺失片段长度为3～3.7 Mb，属于Mark A.Jobling分类中的Ⅰ型。

除了Mark A.Jobling的5种典型分类外，还有许多其他类型的Amel-Y缺失，例如Takayama等［21］报道了日本的一例Amel-Y缺失，缺失片段分为三段，分别位于SY1242（6.44 Mb）和DYS487（8.95 Mb）间、SY59（9.98 Mb）和AC025819U（10.01 Mb）间以及SY1293（9.23Mb），缺失长度分别为2.51Mb、25kb和834b。

大量的数据显示，Amel-Y缺失主要发生在Yp11.2区域，由于各个实验并没有使用统一的STS且样本Amel-Y缺失的断点不同，所以无法很好地分类。根据缺失产生机制不同，一般可以分为两个大类，一类是断点位于TSPYB和TSPYA内的Amel-Y缺失，即Mark A.Jobling的Ⅰ型和Ⅰ-S型（Amel-Y缺失最主要的类型）；另一类是其他情形的Amel-Y缺失，但“46，XX”男性这种特殊类型除外。

2.3 Y-STR缺失情况

Yp11.2内除了Amel-Y（6.78Mb）外，还有4个常用的Y-STR基因座，即DYS393（3.17 Mb）、DYS456（4.31Mb）、DYS458（7.91Mb）和DYS19（10.12Mb）。Y染色体发生微缺失时，这些Y-STR基因座常和Amel-Y一起缺失。DYS458距离Amel-Y最近，只有1.13Mb，且位于TSPYA和TSPYB序列之间，Amel-Y缺失时，常常伴有DYS458缺失，因此DYS458缺失也是Amel-Y可能发生缺失的重要信号。此外，DYS456-Amel-Y-DYS458缺失、Amel-Y-DYS458-DYS19缺失、DYS456-Amel-Y缺失也被报道过［21-29，31-49］。值得注意的是，即使缺失的Y-STR基因座相同，Amel-Y缺失的断点位置和缺失长度也不一定相同，需要进一步采用STS进行精确定位。另外，还有一种特殊的类型：Amel-Y结果为阴性，Y-STR分型结果显示，只有DYS393-DYS456或DYS393-DYS456-DYS458-DYS19存在，一般认为这种特殊类型的Amel-Y缺失属于“46，XX”男性［22-23，37］。“46，XX”男性又称为de la Chapelle综合征，1964年由de la Chapelle等首先报道，属于性反转综合征（sex reversal syndrome，SRS）的一种，主要表现为患者染色体性别与性腺性别不相符，男性新生儿发生率为1∶20000～1∶30000［37］。根据性别决定基因（sex determining region Y，SRY）检测，临床上可将“46，XX”男性SRS分为SRY阳性（90%）及SRY阴性（10%）两类。“46，XX”男性发生机制非常复杂，SRY基因的易位、突变、缺失以及SOX09等基因的变异都可能导致性反转的发生［38］。Y-STR分型结果若只有DYS393～DYS456存在，原因可能是患者父亲在精子形成过程中的第一次减数分裂时Yp～Xp末端发生易位，导致X染色体上带有SRY基因，同时伴随DYS393～DYS456易位到X染色体上［26，38］。Y-STR分型结果若只有DYS393-DYS456-DYS458-DYS19存在，其发生机制可能是IR3反向重复序列之间存在倒位多态性，位于近端反向重复序列IR3内的DYS19先发生倒位，倒位到远端反向重复序列IR3内，然后SRY基因和DYS393-DYS456-DYS458-DYS19再易位到X染色体上［23］。

3　Amelogenin变异的发生机制

Amelogenin变异的发生机制不同，amelogenin引物结合区变异的发生机制是点突变，突变类型包括G→A单点突变［22］、A→G单点突变［22，39］、G→Y（G+A）多点杂合突变［22］、C→G转换［40］和C→T单点突变等［41］。包含amelogenin基因座的Y染色体微缺失，其发生机制可分为两类，一类Amel-Y缺失的断点位于TSPYA和TSPYB内（Ⅰ型和Ⅰ-S型），TSPYA和TSPYB之间发生非等位同源重组（non allelic homologous recombination，NAHR），这种缺失是反复发生的；其他类型Amel-Y缺失的发生机制可能是由于非同源末端连接（non homologous end-joining，NHEJ），这种缺失不会反复发生［15］。

非等位同源重组是指在减数分裂过程中，除了同一位点的同源序列以外，不同位点的重复序列也可能具有高度的同源性，从而发生重组。相同染色体上的同向重复序列间NAHR会导致重复或缺失，反向重复序列间NAHR会导致倒位，不同染色体上的重复序列间NAHR可能会造成染色体易位［42］。Y染色体不会发生等位同源重组（两端的拟常染色体区除外），但Y染色体上有大量的重复序列，TSPYA和TSPYB就是存在于Y染色体内的同向重复序列，二者发生NAHR，即导致Amel-Y缺失；IR3是位于Y染色体上的一对反向重复序列，二者发生NAHR，导致倒位，是目前在Y染色体上发现的唯一一个具有倒位多态性的结构。NHEJ在人类细胞中被用来修复由辐射或者氧化反应引起的DNA双链断裂以及进行生理性的V（D）J重组。与NAHR不同，NHEJ不需要具有同源性的DNA片段作为重组底物，某些由NHEJ介导的CNV的断点倾向于落在重复序列内或者其周围［42］。NAHR和NHEJ使TSPY序列发生拷贝数变异（copy number variation，CNV），从而产生遗传多态性［14］。

由于TSPYB嵌在远端IR3反向重复序列内，所以大多数的IR3发生倒位时，都会保留TSPYB的原始方向而倒位TSPYA，倒位后TSPYA和TSPYB方向相反，这种结构不符合NAHR发生缺失的要求；只有断点位于IR3外侧的末端，倒位后TSPYA和TSPYB方向相同，NAHR后才会产生缺失［15，35］。因而，Amel-Y缺失存在两种方向，在Mark A.Jobling的Ⅰ型缺失中，单倍群为H和D以及R1b3的人群中观察到的序列与参考序列相同，而单倍群为hgI和J2e的人群与参考序列相反，具体的倒位分子细节还待进一步研究［15］。

总之，无论是点突变还是拷贝数变异，都呈现了人类基因组的遗传多态性。

4　Amelogenin变异后的影响

Amelogenin变异后，最直接的影响就是导致X或Y染色体特异性基因座扩增失败。若amelogenin变异发生在Y染色体上，只有Amel-X检出，Amel-Y为阴性，很有可能导致男性样本检见女性分型，造成性别误判。若amelogenin变异发生在X染色体上，虽然不会导致性别误判，但会改变X与Y的峰值比率，从而影响男女混合样本混合比例的判读。另外，Amel-X变异还会影响非整倍型性染色体定量检测，导致染色体数目判断错误。

包含amelogenin基因座的Y染色体发生微缺失时，Yp11.2区内的编码基因也会伴随缺失，但对生殖能力和表型没有明显的影响。

TSPY基因主要编码睾丸特异蛋白，后者参与精子发生。包含amelogenin的Y染色体微缺失，会导致TSPY拷贝数变异，这是否与男性不育有关，目前的报道不多，有些研究的结论彼此矛盾［36］。很多案例中父子Amel-Y都存在缺失［27，37］，这从另一个角度说明了这种缺失对生育能力没有明显的不利影响。

Amelogenin编码牙釉蛋白，Amel-Y缺失的男性可能拥有正常的牙齿，因为Amel-Y的表达只有Amel-X表达水平的10%，所以Amel-Y缺失对牙齿影响极小或者几乎无影响［27，43］。

PRKY在各个组织内表达丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，TBL1Y在前列腺和胎儿脑表达［34］。这些基因的功能尚不明确，但在Amel-Y缺失的男性未发现明显的表型异常［27］。PRKX被认为具有调节肾小管生成的功能，TBL1X在特异性核受体介导的基因激活事件中起着重要作用。TBL1X的缺失与迟发性神经性耳聋有关，如果这些位于X和Y染色体上的同源基因分担相同或者相似的功能，包含amelogenin的Y染色体微缺失男性将在基因产物上存在单倍体剂量不足［44-46］。值得关注的是，患有“45，X”特纳综合征的女性，所有的X-Y同源基因存在单倍体剂量不足，显示肾异常和迟发性神经性耳聋的发生率增长［47］。因此，Amel-Y缺失的男性接受这些表型监测是非常有意义的。

PCDH11基因主要表达于大脑，编码粘钙蛋白（protocadherin，PCDH）δ家族中的δ1型。Speevak等［48］发现一个儿童PCDH11X和PCDH11Y部分缺失，影响了表达与学习语言的能力。单独的PCDH11Y缺失对男性的影响尚不清楚，但是包含amelogenin的Y染色体微缺失男性在这方面未见明显异常。TGIF2LX和TGIF2LY在睾丸中特异性地表达，这些研究结果大多局限于表型或表达模式上的描述，而对于人类TGIF家族的分子功能特别是在发育过程中作用的认识较少［49］。

5　应对amelogenin变异引起性别误判的策略

Amelogenin变异会使Y染色体特异性基因座扩增失败，从而导致性别误判。那么，该如何应对amelogenin变异导致的性别误判呢？

（1）观察Amel-X峰高。在只有Amel-X存在的图谱中，一定要注意观察Amel-X的峰高。理论上，若检材来源于女性，Amel-X的峰高应该与常染色体STR基因座的纯合子峰高相同，是杂合子中一个等位基因峰高的2倍。若Amel-X的峰高与杂合子中一个等位基因峰高相近，为纯合子峰高的1/2，要考虑该样本可能存在amelogenin变异。但是，大部分来源于犯罪现场的检材条件并不是很好，有的是降解检材，有的检材中含有抑制成分，各个基因座的峰高并不是很均衡，因而通过观察Amel-X的峰高来判断amelogenin是否存在变异有一定困难。

（2）用其他包含不同amelogenin引物的复合扩增试剂盒进行核验。例如Identifiler plus试剂盒和EX22试剂盒amelogenin基因座引物是不同的。但是，这种方法只能解决因引物结合区域突变而引起的Amel-Y扩增失败，对于Amel-Y缺失的检材，两种试剂盒的检测结果是相同的，并不能避免男性样本误判为女性样本。

（3）除了amelogenin基因座外，Y染色体上还有许多其他的基因座，可以用包含这些基因座的试剂盒来确定Y染色体是否存在，如Yfiler试剂盒。然而，这种方法耗时耗力，需要更多的检材。法医物证检验的很多检材都是微量的，这种方法不适用于所有检材。

（4）直接采用包含有常染色体STR基因座、amelogenin基因座和Y染色体上其他基因座的复合扩增试剂盒。例如，EX16+18Y试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司），该试剂盒包含15个常染色体STR基因座、1个amelogenin基因座以及18个Y-STR基因座。采用该类复合扩增试剂盒进行检测可以很好地解决上述所有问题，且有效避免因amelogenin变异引起的性别误判。

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（本文编辑：李莉）

Research Progress on Gene Alterations of Amelogenin Locus in Gender Identification

HUANG Jiang-ping，YANG Fan，LIU Ya-nan，ZOU Kai-nan，CAO Yu，WU Dan，CHEN Rong-hua，PING Yuan，ZHOU Huai-gu
（Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China）

There are two kinds of amelogenin gene mutation，including mutation in primer-binding region of amelogenin gene and micro deletion of Y chromosome encompassing amelogenin gene，and the latter is more common.The mechanisms of mutation in primer-binding region of amelogenin gene is nucleotide point mutation and the mechanism of micro deletion of Y chromosome encompassing amelogenin gene maybe non-allelic homologous recombination or non-homologous end-joining.Among the population worldwide，there is a notably higher frequency of amelogenin gene mutations in Indian population，Sri Lanka population and Nepalese population which reside within the Indian subcontinent. Though amelogenin gene mutations have little impact on fertility and phenotype，they might cause incorrect result in gender identification.Using composite-amplification kit which including autosomal STR locus，amelogenin gene locus and multiple Y-STR locus，could avoid wrong gender identification caused by amelogenin gene mutation.

forensic genetics；amelogenin；review；gender identification；mutation

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.013

1004-5619（2016）05-0371-07

上海市科学技术委员会科研计划项目（14JG0500400）

黄江平（1984—），女，主检法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：183689284@qq.com

周怀谷，男，博士，主任法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com

（2016-03-01）