视神经减压术干预兔视神经损伤模型视网膜Caspase-3变化

林琳 买买江·阿不力孜 张永辉 李大志 依马木 昝向阳 栾新平

(1新疆医科大学附属中医医院神经外科; 2新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆 乌鲁木齐 830000)

·经验交流·

视神经减压术干预兔视神经损伤模型视网膜Caspase-3变化

林琳1买买江·阿不力孜1张永辉1李大志1依马木1昝向阳1栾新平2*

(1新疆医科大学附属中医医院神经外科;2新疆医科大学第二附属医院神经外科，新疆 乌鲁木齐 830000)

视神经损伤; 兔视神经损伤模型; 视网膜神经节细胞Caspase-3

外伤性视神经损伤发病率约为0.3%～5.2%，临床上主要治疗方法糖皮质激素和视神经管减压术等均不能有效阻止视神经萎缩的发生[1]。多数患者预后不良，大约50%患者最终失明[2]，因此临床迫切需要明确视神经伤后细胞修复过程、影响因素，运用安全有效的治疗手段。

本研究以白兔的动物模型为研究对象，观察计数视网膜神经节细胞Caspase-3受体阳性表达，来评价临床治疗有效性，为进一步研究视神经损伤的治疗机制奠定基础，并为确定治疗方案及预后提供理论依据。

一、材料与方法

1.实验动物及其分组：96只成年健康新西兰白兔，体重2～2.5 kg。6只为对照组，对90只白兔左眼进行视神经损伤模型制作，随机分为假伤组、模型组、地塞米松影响组、视神经减压术影响组、减压术联合地塞米松影响组，每个组分三个亚组，分别为术后1 d组、7 d组、21 d组，每个亚组6只。

2.视神经损伤动物模型建立：3%戊巴比妥1 ml/kg静脉注射麻醉，在显微镜下暴露视神经，用蛇牌临时动脉瘤夹夹闭20 s，苏醒后放回笼内。观察伤眼瞳孔散大，直接对光反应消失。

3.视神经减压术：动脉瘤夹夹闭20 s后，向球后8 mm锐性分离视神经外包膜组织，达到视神经减压目的。

4.地塞米松给药方法：术后当日开始，按每日每只1 mg/kg剂量，进行肌肉注射，直至达到各处死点。

5.动物处死与病理切片的制备：动物存活到期后处死解剖摘取双侧眼球及视神经。于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋视神经及视网膜，制备石蜡切片，行免疫组化病理检测。

6.计算机图像处理及实验数据的统计: 结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGC)阳性细胞计数方法：高倍显微镜下分别计数视野中可观察到的阳性细胞，数据以均数±标准差表示。

7.统计方法：统计资料为多组定量资料，若分组或时间符合正态、方差齐性，进行方差分析。同时进行不同分组及不同时间的两两比较各组数据用Sasjmp pro计算机统计软件进行统计学分析。各组的计量资料以均数±标准差表示，如Plt;0.05则认为存在差异。

二、结果

1.RGCs Caspase-3的检测：视神经损伤后，各组视网膜Nogo阳性细胞进行计数在后续的各个时间点 1 d、7 d、21 d上述改变具有不同的发展趋势见表1。减压联合地塞米松治疗后1 d、1 w、3 w的视网膜Caspase-3免疫组化病理检测提示阳性率随时间增高(图1～3)。

组别视网膜Caspase计数(个)1d7d21d统计量 单纯夹闭组7．83±1．6016．83±1．7219．17±3．06F=43．27c 单纯减压组11．33±2．8817．50±2．5919．50±3．73F=11．30b 地塞米松组11．50±2．1716．83±3．9722．50±4．32F=13．91a 对照组3．33±1．033．83±1．473．67±1．63F=0．20 假伤组4．17±0．753．50±1．383．67±1．21F=0．55 减压地塞米松组12．17±2．2316．00±3．4621．33±3．33F=13．61d

aPlt;0.05,vs地塞米松组1 d;bPlt;0.05,vs单纯减压组1 d;cPlt;0.05,vs单纯夹闭组1 d;dPlt;0.05,vs减压地塞米松组1 d

图1 兔减压联合地塞米松治疗后1 d的视网膜Caspase-3免疫组化图

图2 兔减压联合地塞米松治疗后1 w的视网膜Caspase-3免疫组化图

图3 兔减压联合地塞米松治疗后3 w的视网膜Caspase-3免疫组化图

2.视网膜Caspase-3阳性细胞计数时间的两两比较：对各组自身在视神经夹闭损伤模型建立后各个时间组 1 d、7 d、21 d进行自身对比：①对照组在与视神经夹闭损伤模型各治疗组，在1 d、7 d、21 d Caspase-3阳性细胞数量除假伤组外均有差异(Plt;0.05)；②单纯夹闭组与视神经夹闭损伤模型各治疗组，1 d均有差异(Plt;0.05)，7 d、21 d除对照组假伤组均没有显著差异(Pgt;0.05)；③地塞米松组：1 d除对照组假伤组外均有差异 (Plt;0.05) ，且具有统计学意义；7 d、21 d(Pgt;0.05)；④单纯减压组：1 d除减压地塞米松组、地塞米松组外均有显著性差异；7 d、21 d除对照组假伤组均没有显著差异(Pgt;0.05)；⑤减压地塞米松组：1 d除减压地塞米松组、地塞米松组外均有差异(Plt;0.05)；7 d、21 d除对照组假伤组均没有显著差异(Pgt;0.05)。

3.Caspase-3阳性细胞的检测分组间的两两比较：①对照组在三个时间点之间视神经细胞数量没有显著差异(Pgt;0.05)；②假伤组三个时间点之间Caspase-3阳性细胞数量没有显著差异(Pgt;0.05)；③地塞米松治疗组Caspase-3阳性细胞数量在1 d、7 d之间，1 d、21 d之间，7 d、21 d之间均有差异(Plt;0.05)；④减压地塞米松治疗组Caspase-3阳性细胞数量在1 d、21 d之间7 d、21 d之间有差异(Plt;0.05)，1 d、7 d之间、对照没有显著差异(Pgt;0.05)；⑤单纯减压治疗组视神经细胞数量在1 d、7 d之间1 d、21 d之间有差异(Plt;0.05)(表1)，21 d、7 d之间没有显著差异(Pgt;0.05)，且不具有统计学意义；⑥单纯夹闭组Caspase-3阳性细胞数量在1 d、21 d之间，1 d、7 d之间有差异(Plt;0.05)，7 d、21 d组之间没有显著差异(Pgt;0.05)。

三、讨论

以往传统观点称，一旦损伤成年动物视神经胞体或轴突，视神经及视网膜神经节细胞就将不可逆转的损伤及死亡。视神经是中枢神经系统的白质束的延伸部分，损伤后修复过程与周围性神经修复完全不同。防止伤后视网膜神经节细胞的继发性凋亡是挽救外伤性视神经病变患者视力的唯一途径。

实验证实[3]尽管存在多种多样的凋亡信号及反应途径，几乎所有凋亡的启动及执行过程中都需要蛋白质的特异性酶切。Caspase是半胱氨酸蛋白酶家族的总称，其在细胞凋亡的过程中起着至关重要的作用。Caspases是多种细胞死亡启动和执行的关键分子。在变性的RGC中直接检测到了Caspase-3 被激活并证实使用Caspase-3 抑制剂、Caspases-9 抑制剂可阻止去轴索诱导的视网膜神经节细胞死亡。本研究证实急性视神经损伤可以促使Caspase-3阳性表达上调，表明Caspase-3阳性表达在视神经损伤的神经再生过程中发挥着重要作用。

目前使用糖皮质激素为主的药物治疗法和手术治疗法是最常用的治疗手段，视神经管减压术已成为目前主要的手术治疗方法。McKerracher认为视神经损伤后会因视神经管空间的限制，出现进行性血液循环障碍和/或组织水肿，视神经减压术是解除直接压迫，缓解神经肿胀及血管痉挛，对于视神经损伤有一定的疗效；地塞米松对于视神经损伤有着皮质激素可通过其抗氧化作用减轻自由基对细胞膜结构的损伤而使水肿减轻，同时阻断外伤性炎症介质及血管活性物质的产[4,5]。

本研究结果显示：地塞米松、手术减压、地塞米松联合手术减压三种治疗手段7 d、21 d结果无差异(Pgt;0.05)无统计学意义，提示临床上7 d内运用Caspase-3抑制剂或其他治疗手段对阻止细胞凋亡死亡具有重要意义。但这一实验结果尚需进一步的分析。

目前临床上视神经损伤程度是神经恢复的决定因素。本实验通过视神经夹伤模型，观察到Caspase-3在损伤视神经及视网膜的表达，及各治疗组对其表达在3个时间点的作用差异评价，对进一步研究视神经损伤机制具有一定的参考价值。

1Levkovitch-Verbin H, Dardik R, Vander S, et al. Mechanism of retinal ganglion cells death in secondary degeneration of the optic nerve [J]. Exp Eye Res, 2010, 91(2): 127-134.

2刘晓坤, 罗钢, 赵平, 等. 重组人促红细胞生成素对大鼠挫伤视神经超微结构的保护作用 [J]. 眼科新进展, 2013, 33(3): 229-232.

3姜晓璇, 马林昆, 曹霞. 视神经损伤后基因治疗技术的研究进展 [J]. 中华实验眼科杂志, 2014, 32(8): 748-751.

4林鹏, 夏鹰, 金虎, 等. 经颅视神经管减压术治疗外伤性视神经损伤 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2014, 19(2): 77-78.

5黄旅黔, 王忠安, 朱康生, 等. 经颅视神经管减压术治疗外伤性视神经损伤 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2004, 3(5): 460-461.

1671-2897(2016)15-082-03

R 651

B

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(200821137)

林琳，主任医师，E-mail：115128726@qq.com

*通讯作者：栾新平，主任医师，E-mail：Luanxinping4324177@163.com

2014-09-12；

2015-08-20)