复合菌发酵海藻渣降解甲醛残留工艺研究

苏东海+魏玉西+陈应运+陈婷婷

摘要：以海藻渣为研究对象，使用自制复合菌剂进行发酵，以甲醛含量作为主要评价指标，在单因素试验基础上，采用正交试验优化发酵工艺条件。结果表明，复合菌剂发酵海藻渣最佳工艺条件为培养基组成为海藻渣100 g、麸皮20 g、豆粕25 g，发酵温度为45 ℃，发酵时间为10 d，复合菌剂接菌量为5%，海藻渣采用优化工艺经复合菌发酵后甲醛含量可由367.88 mg/kg降至57.14 mg/kg。

关键词：海藻渣；复合菌；发酵；甲醛

中图分类号： S188+.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0495-03

我国海藻养殖量居世界首位。海藻工业产值在海洋经济中占有重要地位。海藻营养丰富，具有药用、食用等多种用途[1]。海藻渣是褐藻（海带、巨藻等）经过一系列工序提取海藻胶、碘、甘露醇等产品后所剩余的废弃物[2]。研究发现，海藻渣内仍有大量的营养物质（如蛋白质）和粗纤维，且其蛋白质组成中精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量较高，因而有可能成为食品原料或动物饲料的组成成分[3]。尽管如此，由于海藻加工过程中浸泡工序使用甲醛作为固色剂[4]，致使藻渣因甲醛残留高，加之海藻渣粗纤维含量高达35%以上，海藻渣不宜直接用于动物饲料。目前，我国海藻加工企业将大部分海藻渣经简单沤制后用作肥料，对农作物具有一定的营养、抗病、增产的功效[5-6]。但是，现有海藻渣的利用效率不高，亟待进行高值化利用研究。

利用微生物发酵，改善食物的口感、风味，甚至生产出高值化功能性产品，已经深入人类生活的诸多方面[7-12]。微生物发酵饲料早在20世纪90年代就在我国被广泛应用，分别经历了糖化饲料、酵母饲料以及如今的微生物发酵饲料发展阶段[13]。由于海藻渣组成的特殊性，将其作为饲料的研究备受关注。韩玲证实了海藻粉作为饲料添加剂的可行性[14]。然而，采用海藻渣作为饲料添加剂，尚面临海藻生产过程中因使用甲醛造成的蛋白质结构改变（交联）问题，从而影响其作为动物饲料蛋白质的吸收利用。本研究利用自制复合菌剂，以甲醛含量为评价指标，对海藻渣发酵工艺进行探索，以期为将海藻渣作为动物饲料添加剂利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

海藻渣、麸皮、红糖、豆粕均为市售。复合菌剂由青岛大学生命科学学院自制。甲醛标准溶液从中国计量科学研究院购置。

1.2 仪器与设备

电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；721G型可见分光光度计（上海精密仪器有限公司）；101-3A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料处理 海藻渣为烘干的颗粒状固体，过20目筛，放置阴凉干燥处备用。

自制复合菌剂配制：将无菌水、红糖、菌粉按质量比15 ∶1 ∶0.1 比例配制，30～40 ℃活化5～7 d后，经pH试纸测试显酸性则为活化成功，密封备用。

1.3.2 复合菌剂发酵海藻渣的工艺

参照文献[15-16]中复合菌剂发酵海藻渣的工艺，并加以改进。取100 g海藻渣，分别添加一定量的麸皮、豆粕作为碳源、氮源，混匀后加入稀释后的菌液，添加量以握手成团、松开即散的程度为准。在一定温度下厌氧培养、固态发酵，直至发酵品发出浓郁酒曲香味为发酵终点。

1.3.3 甲醛含量测定

采用乙酰丙酮分光光度法对甲醛含量进行检测[17-18]。

乙酰丙酮溶液制备：将乙酸铵25 g、冰乙酸3 mL、乙酰丙酮溶液0.25 mL试剂定容至100 mL水中。

标准曲线制作：配制10.4 μg/mL甲醛标准溶液，分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL甲醛标准溶液，加入到25 mL 具塞比色管中，加水至10 mL，分别加入2 mL乙酰丙酮溶液，混匀后于100 ℃水浴中加热15 min。取出冷却后，于波长412 nm处测定吸光度。每个处理重复3次。以甲醛浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程。

样品处理：称取样品15 g，用100 mL 50 ℃蒸馏水洗入250 mL容量瓶中，加入10 mL冰醋酸，85 ℃水浴1 h，取出冷却至室温，加入亚铁氰化钾溶液2.5 mL、乙酸锌溶液2.5 mL以除去蛋白质，以蒸馏水定容，摇匀静置，去除上层脂肪。经过滤，舍弃30 mL初滤液，再过滤得待测滤液。

显色反应：取样品滤液2 mL于比色管中，定容至10 mL，加入乙酰丙酮溶液2 mL于100 ℃水浴中反应15 min，取出冷却，于波长412 nm处测吸光度，根据标准曲线计算甲醛含量：样品中甲醛含量（mg/kg）=标准曲线算得甲醛含量（μg/mL）×125/15。

1.3.4 复合菌剂发酵海藻渣的单因素试验 以乙酰丙酮法测定发酵样品甲醛含量，以此评价发酵效果并确定单因素数值范围。

1.3.4.1 麸皮添加量的选择 取海藻渣100 g，分别添加5、10、15、20、25 g麸皮，20 g豆粕，接入质量分数3%的菌液，调节湿度后放入37 ℃恒温培养箱发酵6 d。

1.3.4.2 豆粕添加量的选择 取海藻渣100 g，添加20 g麸皮，分别添加10、15、20、25、30 g豆粕，接入质量分数3%的菌液，调节湿度后放入37 ℃恒温培养箱发酵6 d。

1.3.4.3 接种量的选择 取海藻渣100 g，添加20 g麸皮，25 g 豆粕，分别接入质量分数1、2、3、4、5、6%的菌液，调节湿度后放入37 ℃恒温培养箱发酵6 d。

1.3.4.4 发酵温度的选择 取海藻渣100 g，添加20 g麸皮，25 g豆粕，接入质量分数5%的菌液，调节湿度后分别放入29、33、37、41、45 ℃恒温培养箱发酵6 d。

1.3.4.5 发酵时间的选择 取海藻渣100 g，添加20 g麸皮，25 g豆粕，接入质量分数5%的菌液，调节湿度后放入41 ℃恒温培养箱分别发酵4、6、8、10、12 d。

1.3.5 正交试验方案设计 根据单因素试验结果，在复合菌接种量为5%条件下，选用L9（34）正交试验表，综合考察麸皮添加量、豆粕添加量、发酵温度、时间对复合菌剂发酵海藻渣的影响。正交试验因素与水平见表1。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 海藻渣中甲醛含量的测定结果

按照“1.3.3”节中的方法制作甲醛标准曲线，得出回归方程：y=0.021x+0.006（r2 = 0.999 3）。测得原海藻渣中甲醛含量为367.875 mg/kg。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 麸皮添加量对甲醛含量的影响 由图1可知，在一定范围内，海藻渣发酵品发酵前后甲醛含量的差值随麸皮添加量增加而增加，当麸皮添加量为15%时，经复合菌发酵的海藻渣中甲醛含量下降最多，随后下降量减少。这可能是因为麸皮添加量过多时，复合菌过多地利用麸皮，而减少了对海藻渣的降解。

2.2.2 豆粕添加量对甲醛含量的影响 由图2可知，在一定范围内，海藻渣发酵品发酵前后甲醛含量差值随豆粕添加量增加而增加，当豆粕添加量为20%时，经复合菌发酵的海藻渣中甲醛含量下降最多，随后下降量减少。这可能是因为豆粕添加量过多时，复合菌更多地分解豆粕，减少了对海藻渣的降解。

2.2.3 复合菌剂接种量对甲醛含量的影响 由图3可知，海藻渣发酵品甲醛含量随着复合菌剂接种量的增加而逐渐降低，当复合菌剂接种量超过5%后，发酵品中甲醛含量不再有明显降低，这可能是因为复合菌剂达到了最大发酵接种量。

2.2.4 发酵温度对甲醛含量的影响 由图4可知，在一定范围内，海藻渣发酵品甲醛含量随发酵温度的升高而降低，当发酵温度达41 ℃时，发酵品中甲醛含量最低；当发酵温度继续升高，发酵品中甲醛含量随之增多。说明41 ℃为复合菌降解甲醛的最佳温度，这可能是因为温度过高抑制了复合菌生长及分解作用，不利于海藻渣降解。

2.2.5 发酵时间对甲醛含量的影响 由图5可知，海藻渣发酵品中甲醛含量随发酵时间延长而降低，当发酵时间超过10 d 时，发酵品中甲醛含量随发酵时间延长不再明显降低，这可能因为发酵产物抑制了复合菌生长，降低了其分解海藻渣的能力。

2.3 正交试验结果

由表2中的极差（R）值可知，各因素对甲醛含量影响的大小顺序依次为发酵温度>发酵时间>豆粕添加量>麸皮添加量。通过分析k1、k2、k3可知，最优工艺组合为A3B3C3D2，在该条件下，发酵的海藻渣样品，甲醛含量由未经发酵的367.88 mg/kg降至发酵后的57.14 mg/kg，该结果均小于9组正交试验结果，证明该工艺所得最优组合的可靠性。

3 结论与讨论

以海藻加工废渣为原料，辅以麸皮、豆粕为碳源、氮源，以复合菌为发酵菌剂进行发酵，开展单因素试验及正交试验。结果表明：在海藻渣中添加20%麸皮和25%豆粕，在45 ℃下发酵10 d，发酵产物中甲醛含量最低，甲醛含量可由367.88 mg/kg 降至57.14 mg/kg。

本研究通过复合菌发酵海藻渣，降解其生产加工过程中变性的纤维素及蛋白质，释放并利用海藻加工时大量残留的甲醛，该工艺方法具有可行性。本研究为海藻渣应用于牲畜、鱼类饲料或其他高值化应用奠定了基础。

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