高效液相色谱法测定秸秆浸提液或腐解液中12种酚酸

于建光，常志州，王 宁，石祖梁，卢 信，张传辉

（1.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，南京 210014；2.农业部江苏耕地保育科学观测实验站，南京 210014）

高效液相色谱法测定秸秆浸提液或腐解液中12种酚酸

于建光1，2，常志州1，王 宁1，石祖梁1，卢 信1，张传辉1

（1.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，南京 210014；2.农业部江苏耕地保育科学观测实验站，南京 210014）

建立了同时测定秸秆浸提液或腐解液中12种酚酸物质（没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水杨酸）的反相高效液相色谱测定方法。采用Waters HLB（500 mg、60 μm、6 mL）固相萃取小柱对水溶液中的酚酸物质进行浓缩，以含0.5%乙酸的乙腈和0.5%乙酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱，选用二极管阵列检测器，30 min内可对12种酚酸物质同时检测，各种酚酸均可达到基线分离。加标回收试验表明，样品中12种酚酸类化合物的加标回收率为79.41%～101.92%，12种酚酸保留时间和峰面积的RSD分别在0.02%～0.1%和0.25%～2.26%之间。该方法快速、灵敏、准确，适用于同时测定秸秆浸提液、腐解液、土壤溶液及水溶液中12种酚酸物质含量。

高效液相色谱；秸秆浸提液；秸秆腐解液；酚酸

秸秆还田作为一项有效的秸秆处置措施被广泛采用，报道中大多肯定其良好的环境与生态效应[1]，但其所产生的负面效应如化感效应等也不容忽视[2]。由秸秆还田所产生的化感效应主要表现为秸秆分解释放的化感物质酚、酸、醛、酮等化合物对作物发芽、出苗及根产生抑制[3-4]，尤其是酚酸类物质在农林生态系统中普遍存在[5-7]，且大多数均有化感效应。本课题组的研究结果表明，小麦秸秆浸提液和腐解液对水稻种子的萌发和幼苗生长发育产生抑制作用，其作用与秸秆含有或腐解产生的酚酸有关[8]，并在随后的酚酸纯品模拟试验中得以确认[9]。

准确鉴定不同还田条件下土壤和秸秆中的酚酸物质种类并确定其含量有助于正确评估酚酸物质在秸秆化感效应中的作用，进而可有针对性地研发秸秆还田技术和指导秸秆还田工作。不同植物残体化感效应中的酚酸种类不同，如大豆根系分泌物和植株水浸液中有香草酸、香草醛和对羟基苯甲酸等[10]，柑橘园主要为高香草酸[11]，向日葵秸秆中主要为绿原酸[12]，稻草、锯木屑、猪粪腐解释放对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸、阿魏酸[13]，小麦秸秆中有阿魏酸、对羟基苯甲酸和苯甲酸[14-15]。上述报道中涉及的酚酸物质多为1种或几种酚酸，而多种酚酸物质含量测定的报道主要集中于食品和药品[16-17]，如咖啡豆中的6种酚酸类化合物[18]，大麦籽粒中的13种酚酸[19]，向日葵籽中的2种酚酸[20]等。

由于秸秆中酚酸或秸秆腐解产物中直接起作用的有效组分以水溶态为主[21]，已有报道中涉及酚酸测定的方法不适用于秸秆浸提液和腐解液中酚酸含量测定，如酚酸浓度较高且种类与秸秆中不同[22]，未考虑如何从水相中富集提纯酚酸[23]，从水相中化学萃取但试剂消耗量过大[24]，而用于较全面测定秸秆中酚酸物质尤其是水溶性酚酸含量的方法未有报道。本文拟对秸秆浸提液或腐解液中常见的12种酚酸的测定方法进行开发，以期为正确评估酚酸类物质在秸秆还田中的化感效应和在还田技术中引入化感效应调控措施提供方法参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪Agilent HPLC1200，真空在线脱气机G1322A，四元泵G1311A，柱温箱G1329A，安捷伦Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm、粒径5 μm）色谱柱，保护柱为XDB C18小柱（4.6 mm×12.5 mm，粒径5 μm），标准自动进样器G1329A，DAD检测器G1315D，化学工作站为ChemStation B04.02。

旋转蒸发仪（Buchi Corp.，R-210，真空泵V-700），固相萃取仪（天津恒奥科技公司，HSE-08），SQP型电子天平（Sartorius Corp.），0.45 μm有机相一次性针头式滤器（天津津腾实验设备有限公司）。Eppendorf移液器、25 mL棕色容量瓶（Schott Corp.），超纯水由纯水机制备（爱科谱公司）。甲醇、乙酸、乙腈均为色谱纯试剂（Merck Corp.），流动相配制后均经超声处理方可使用。固相萃取小柱分别为Biotage ABN（200 mg、50 μm、6 mL）、Waters C18（500 mg、79 μm、3 mL）、Waters HLB（500 mg、60 μm、6 mL）。

没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水杨酸等12种酚酸标准品均购自Sigma公司，除原儿茶酸、绿原酸、香草酸和丁香酸纯度为95%～97%外，其余酚酸纯度均在99%以上。

1.2 色谱条件

流动相为含0.5%乙酸的乙腈和含0.5%乙酸的超纯水，色谱柱：0～25 min乙腈5%～20%，25～26 min乙腈20%～5%，26～28 min乙腈5%，流速为1 mL· min-1，柱温30℃，进样量5 μL；二极管阵列检测器检测260、270、310、325 nm波长的色谱图，以峰面积外标法定量。

1.3 标准溶液的配制

准确称取上述12种酚酸标准品各25 mg，全部置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得1 mg· mL-1的12种酚酸溶液混合液，将其依次用甲醇溶液稀释得500、250、100、50、20、10、5、1 μg·mL-1系列混合溶液。同时准确称取12种酚酸标准品各25 mg，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得1 mg·mL-1的单一种酚酸溶液，用于液相色谱单峰的鉴别与定性。

1.4 标准物质加标回收率测定

分别准确称取12种酚酸标准品各20 mg置于烧杯中，加两滴甲醇溶解，随后加超纯水定容于2 L容量瓶中，得10 μg·mL-1的12种酚酸混合水溶液；吸取该酚酸混合水溶液100 mL过预先经活化的固相萃取小柱，用10 mL甲醇溶液进行样品收集，将收集液转入旋转蒸发仪，40℃下进行旋蒸，旋蒸至干后加2 mL甲醇定容收集并过0.45 μm滤器后上HPLC测定。通过测定数据计算3种不同固相萃取小柱萃取浓缩后各种酚酸的回收率，小柱均为一次性使用，每种固相萃取小柱回收试验均重复3次。

1.5 秸秆浸提液、腐解液制备及酚酸含量测定

水稻秸秆浸提液和腐解液分别通过下述方法获得：水稻秸秆浸提液E10，将成熟水稻秸秆与水以1∶10（质量g∶体积mL，W/V）在20℃下浸提24 h后静置，上清液先经4层纱布过滤、后经Whatman滤纸过滤，即为10%溶液（E10）；水稻秸秆腐解液D10，将水稻秸秆、土壤和纯水以1∶1∶10（质量g∶质量g∶体积mL，W/W/ V）20℃振荡混合淹水培养7 d后静置，上清液先经4层纱布过滤、后经Whatman滤纸过滤，即为10%腐解液（D10）。上述E10和D10溶液的获得均重复3次。

将E10或D10通过冷冻离心机1800 r·min-1离心10 min后过滤，采用与酚酸标准溶液同样的方法通过固相萃取小柱，然后在40℃下旋蒸浓缩为2 mL，采用与上述标准酚酸溶液完全相同的方法通过液相色谱仪，根据待测组分的信号，用回归方程计算出样品的实测浓度。

2 结果与讨论

2.1 天然酚酸类化合物测定波长的选择

通过将各酚酸单一组分溶液经过高效液相色谱仪后进行光谱扫描（DAD），确定各酚酸的最大吸收峰，与已有的文献进行对照，并综合考虑各酚酸物质最大吸收峰和溶剂的截止波长，然后分类选择可共用的波长，选定结果如表1。

表1 12种酚酸经HPLC-DAD测定时采用的紫外波长Table 1 UV wavelength of 12 kinds of phenolic acids measured by HPLC-DAD

2.2 流动相的选择和优化

结合文献报道[23]，发现流动相为CH3CN-H2O系统时的峰形和选择性比CH3OH-H2O有明显改善，但峰形仍不理想，加入酸性抑制剂后，分离度明显改善，且峰形变为锐峰，符合分离要求。

采用等度洗脱时，各峰分离不理想，采用梯度洗脱后分离较好，经多次梯度洗脱条件优化，最理想的洗脱条件为：0～25 min乙腈5%～20%，25～26 min乙腈20%～5%，26～28 min乙腈5%，流速为1 mL·min-1。

2.3 峰的归属和纯度检查

分别将适量单一酚酸标准溶液加入混合标样中，随即进行分析，通过与加入前的谱图进行对比，将吸光度明显增大的峰认定为该酚酸的峰，并将其谱图与相应的已知标准品谱图进行比较加以印证，逐一确认12种酚酸的相应峰位和出峰时间。

2.4 12种酚酸的工作曲线及检测限

将已逐级稀释配制的12种酚酸混合甲醇溶液分别进样5 μL，记录对应峰面积；以浓度x（μg·mL-1）为横坐标，峰面积值y（mAU）为纵坐标绘制标准曲线，得到12种酚酸物质的线性回归方程、相关系数及线性范围。再分别配制0.5、0.25、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.001 μg·mL-1标准酚酸混合溶液，分别获得各溶液的色谱图（图1），以仪器信噪比确定12种酚酸的最低检出限（S/N≥3，表2）。

方法精密度测定：将1 μg·mL-1的酚酸混合标准溶液在同一天内连续进样5次，获得保留时间和相应的峰面积计算相对标准偏差（RSD），12种酚酸保留时间和峰面积的RSD分别在0.02%～0.10%和0.25%～2.26%之间，重现性良好（表2）。

2.5 12种酚酸固相萃取回收率测定

3种固相萃取小柱对12种酚酸水溶液的浓缩回收率差异较大，其中ABN和C18对6种酚酸的回收率均不到60%，而HLB对所有12种酚酸的回收率为79.41%～101.92%。这表明HLB适用于本研究中所选12种酚酸的浓缩回收（表3）。究其原因认为，不同于传统的硅胶基质固相萃取小柱，HLB为水浸润型聚合物固相萃取小柱，其所含的HLB聚合物表面有亲水性和疏水性基团，非常适合于含水样品中极性与非极性有机化合物的同时提取，因而对水溶液中酚酸进行富集可获得较高的回收率，同时其使用成本也高于另外两种小柱。

2.6 水稻秸秆浸提液和腐解液中12种酚酸物质的含量

水稻秸秆在20℃下经24 h浸提后，采用上述测定方法可检测到浸提液中含有10种酚酸物质，其含量介于0.59～28.59 ng·mL-1间（表4）。水稻秸秆在20℃下经7 d腐解后，采用上述同样方法可检测到腐解液中含有5种酚酸物质，其含量介于1.18～349.48 ng· mL-1间（表4）。水稻秸秆浸提液中酚酸主要来源于秸秆自身携带的次生代谢产物，而水稻秸秆经7 d分解后，秸秆中纤维素和木质素均可降解产生酚酸，因而它们的酚酸种类与含量均不同。

图1 12种酚酸混合标准样品HPLC-DAD色谱分析图Figure 1 HPLC-DAD chromatogram of a mixture of 12 phenolic acid standards

3 结论

（1）采用Waters HLB固相萃取小柱对秸秆浸提液或腐解液中的酚酸物质进行富集，经梯度洗脱、二极管阵列检测器4个波长检测，30 min内12种酚酸所对应的吸收峰均可达到基线分离。

（2）该方法可快速、灵敏、准确地富集并测定秸秆浸提液、腐解液和土壤溶液中常见12种酚酸物质的含量，可为正确评估酚酸类物质在农林地及水体中的化感效应提供技术支持。

表2 12种酚酸的保留时间、相对标准偏差、线性方程、相关系数、线性范围及检测限Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r），linear ranges and limits of detection of 12 phenolic acids

表3 12种酚酸样品经SPE后HPLC测定回收率（%）Table 3 Spiked recoveries and precisions（RSD）of 12 phenolic acids

表4 稻秸浸提液和腐解液中12种酚酸含量Table 4 Content of 12 kinds of phenolic acid in rice straw extract and decomposed liquid

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Determination of 12 phenolic acids in straw extract or straw decomposed liquid through high performance liquid chromatography

YU Jian-guang1,2,CHANG Zhi-zhou1,WANG Ning1,SHI Zu-liang1,LU Xin1,ZHANG Chuan-hui1
（1.Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.Scientific Ob-Serving and Experimental Station of Arable Land Conservation（Jiangsu）,Ministry of Agriculture,Nanjing 210014,China）

A method of reversed phase high performance liquid chromatography was established,which could be used to determine the contents of 12 phenolic acids（gallic acid,protocatechuic acid,gentisic acid,p-hydroxybenzoic acid,chlorogenic acid,vanilla acid,coffee acid, syringic acid,p-coumaric acid,ferulic acid,sinapic acid,salicylic acid）simultaneously in straw extract or decomposed liquid.Waters HLB（500 mg,60 μm,6 mL）solid-phase extraction cartridges were used to concentrate phenolic acids in aqueous solution.The gradient elution was carried out using acetonitrile solution containing 0.5%acetic acid and 0.5%acetic acid solution as the mobile phase.The diode array detector was used for detection,and the determination of 12 kinds of phenolic acids could be completed simultaneously in 30 minutes.All of phenolic acids could reach the baseline separation.The recovery rate of 12 phenolic acids were between 79.41%～101.92%,and the RSD of retention time and peak area of 12 phenolic acids were between 0.02%～0.1%and 0.25%～2.26%,respectively.This method is rapid,sensitive and accurate,suitable for the simultaneous determination of 12 phenolic acids existed in straw extract,straw decomposed liquid,soil solution and aqueous solution.

high performance liquid chromatography;straw extract;straw decomposed liquid;phenolic acids

S153.6

A

1672-2043（2016）11-2231-06

10.11654/jaes.2016-0591

2016-04-27

国家自然科学基金项目（41271308）；公益性行业（农业）科研专项（201503136）；江苏省自然科学基金项目（BK2011672）；江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（12）1002]

于建光（1975—），男，山西忻州人，博士，副研究员，研究方向为农田土壤退化与修复。E-mail：yujg@jaas.ac.cn

于建光，常志州，王宁，等.高效液相色谱法测定秸秆浸提液或腐解液中12种酚酸[J].农业环境科学学报,2016,35（11）：2231-2236.

YU Jian-guang,CHANG Zhi-zhou,WANG Ning,et al.Determination of 12 phenolic acids in straw extract or straw decomposed liquid through high performance liquid chromatography[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2231-2236.