人源细粒棘球蚴喙钩形态学参数分析

张尔夫,王 斯,杜 峰,安春丽



人源细粒棘球蚴喙钩形态学参数分析

张尔夫1,2,王 斯1,杜 峰1,安春丽1

目的 测定本地区人源细粒棘球蚴喙钩的形态学参数，为棘球蚴的分类及流行病学研究提供依据。方法 以外科手术的方法从患者肝脏分离肝包虫，取囊液等内容物离心沉淀制成涂片标本，光学显微镜下观察，根据形态确定棘球蚴原头蚴的喙钩，应用计算机图像分析系统采集喙钩总长、总宽、柄长、刀长4个形态学参数数据，用统计学软件进行统计分析。结果 棘球蚴的原头节上具有上下两层喙钩，上层为大钩，下层为小钩。分别采集到游离状态的大钩56个，小钩49个，测量并获得了两种喙钩的4个形态学参数：大钩的总长、总宽、柄长、刀长的平均值分别为12.38 μm、4.58 μm、5.51 μm和6.51 μm；小钩的总长、总宽、柄长、刀长的平均值分别为10.41 μm、3.76 μm、5.04 μm和4.72 μm。大钩和小钩的各项形态学参数比较结果具有统计学意义(P<0.05)。结论 本研究应用计算机图像分析系统获得本地区人源细粒棘球蚴喙钩的形态学参数，为棘球蚴的分类鉴定及流行病学研究提供了可靠的形态学资料。

细粒棘球蚴；人源；喙钩；形态学；计算机图像分析系统

由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)幼虫引起的棘球蚴病(Hydatid disease)，又称囊型包虫病(cyctic echinococcosis, CE)，或简称为包虫病，是一种危害极大的人畜共患寄生虫病。包虫病呈全球性分布，主要流行于地中海地区，俄罗斯，中亚，中国，澳大利亚，南美洲，北美洲和非洲东部亚洲。我国也是棘球蚴病流行比较严重的国家之一，目前有27个省(市)自治区有本病的分布[1]，其中甘肃、宁夏、青海、新疆、内蒙、西藏及四川西部等地区流行更为严重[2]。国家已将棘球蚴病列为《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2020年),并将其列入国家免费救治的重大传染病之一[3]。

细粒棘球绦虫的幼虫，即棘球蚴，宿主广泛，可寄生于羊、牛、马、驴、骡、骆驼及猪等多种动物及人体内,不同地区、不同宿主源和不同寄生部位的棘球蚴存在形态、大小及致病性等方面的差异。虽然伴随着分子生物学技术的发展，对细粒棘球绦虫的认识已经上升到了基因水平，但是对该虫的形态学观察与鉴定依然是诊断该病的一种简单、快速、经济、可靠的常用手段，也在虫种鉴定、分类及流行病学分析等方面起到了不可或缺的作用。Gholamreza等[4]认为，对来自不同中间宿主和终宿主体内的幼虫和成虫进行形态学特征的测量是一种确实可行的分型方法。还有一些学者[5-6]指出，细粒棘球绦虫的喙钩在从中间宿主转移到终宿主的过程中其形态特征将保持不变，可以通过测量该虫喙钩的形态学特征参数来追踪终宿主的感染源。

国外已有对细粒棘球蚴喙钩形态学研究的相关报道，国内仅有对动物体内细粒棘球幼喙钩测量数据的报道[7]，尚未见对人体内细粒棘球蚴喙钩形态特征参数的报道。本文应用计算机图像分析系统(computer image analysis system, CIAS)对从我国辽宁西部一例人体分离的细粒棘球蚴喙钩形态特征进行研究分析，获得我国人源棘球蚴原头节喙钩的形态资料，对比国外资料进行分析，期望为棘球蚴的分类学、流行病学以及防治策略等方面的研究提供形态学参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 样本来自辽宁西部1例女性肝包虫病患者，通过外科手术从其肝脏切除完整囊包，用生理盐水冲洗后收集其囊内容物，加入75%的酒精，置4 ℃保存待用。取囊液及其囊内容物1 000 r/min 5 min 离心2次后取沉淀，制成涂片标本置光学显微镜(OLYMPUS BX53，日本)观察。

1.2 测量方法 经显微镜放大400×观察，可见喙钩在原头蚴内的排列情况(图1)以及原头蚴顶突外翻后喙钩的排列情况(图2)，原头蚴的喙钩分为上下两排，依据国外学者[8-10]对大、小喙钩的鉴定标准，区分和测量本例标本的喙钩，并依据这些特征定义大钩与小钩(图3)。通过计算机图像分析软件(OLYMPUS cellSens)对所选取形态规整的喙钩进行测量，其中大钩56个、小钩49个为测量对象，测量参数包括喙钩的长径长度(总长total length, TL)、短径垂直长度(总宽total width, TW)、喙钩头到钩卫的长度(柄长handl length, HL)及钩卫到喙钩尾的长度(刀长blade length, BL)(图4)。

1.3 统计方法 应用软件Excel 2003及GraphPad Prism 5.0对所测得的参数数据进行整理、统计学分析，P<0.05具有统计学意义。

图1 原头蚴体内喙钩(箭头所指)Fig.1 Hooks in protoscoleces (arrow)

图2 原头蚴顶突外翻后的喙钩(箭头所指)Fig.2 Hooks of evaginated protoscolex(arrow)

图3 大钩(右)与小钩(左)Fig.3 Large hook (right) and small hook (left)

2 结 果

2.1 测量结果 分别测量了56个大钩和49个小钩的总长、总宽、柄长、刀长4个形态参数的数据，得到大钩的总长、总宽、柄长、刀长平均值分别为12.38 μm(11.04～13.77 μm)、4.58 μm(3.75～5.77 μm)、5.51 μm(3.83～6.92 μm)、6.51 μm(5.30～8.57 μm)，小钩的总长、总宽、柄长、刀长平均值分别为10.41 μm(7.88～11.81 μm)、3.76 μm(3.08～4.93 μm)、5.04 μm(2.68～6.83 μm)、4.72 μm(3.23～5.81 μm)，其它形态学参数统计指标数据见表1。

2.2 统计结果 应用软件GraphPad Prism 5.0采用Unpaired t test进行统计学分析，结果大钩与小钩的总长、总宽、柄长、刀长差异都具有统计学意义，其中总长、总宽、刀长的差异极具有统计学意义(P<0.000 1)(图5)，同时又对大钩的总长分别与总宽(r=0.328 9)、柄长(r=0.497 3)、刀长(r=0.312 4)及小钩的总长与总宽(r=0.488 2)、柄长(r=0.577 3)、刀长(r=0.625 9)的相关性做了统计分析，结果显示具有相关性，有统计学意义(P<0.005)(图6)；而分别对大钩的柄长和刀长及小钩的柄长和刀长做相关性分析，没有得出相关性结论，无统计学意义。

黑色箭头分别指示出喙钩的头、卫、尾3个位置，黄色线段表示总长、白色线段表示总宽、红色线段表示柄长、蓝色线段表示刀长The arrows indicate respectively handle, guard, blade; the yellow line indicates TL; the white line indicates TW; the red indicates HL; the blue line indicates BL.图4 喙钩及测量参数标示图Fig.4 Pictorial view of rostellar Hook and parameters

表1 喙钩形态学参数统计指标数据(μm)
Tab.1 Morphological parameters of rostellar hooks (μm)

大钩(n=56)Largehook(n=56)小钩(n=49)Smallhook(n=49)总长Totallength总宽Totalwidth柄长Handlelength刀长Bladelength总长Totallength总宽Totalwidth柄长Handlelength刀长Bladelength平均值Average12.384.585.516.5110.413.765.044.72最大值Maximum13.775.776.928.5711.814.936.835.81最小值Minimum11.043.753.835.307.883.082.683.23标准差Standarddeviation0.680.450.630.670.890.410.870.65变异系数CV0.060.100.110.100.090.110.170.14

2.3 本例测定的结果与文献报道的数据对比 将本例测定的大钩和小钩的长度与文献报道的数据进行比较，结果如表2所示，本例测量结果与国外学者Yildiz[11]报道的土耳其羊源和牛源棘球蚴测量的大钩与小钩长度结果较相近，与Layla[12]报道的利比亚的羊源和骆驼源、Ahmadi[13]报道的伊朗人源和羊源及Ponce[14]报道的西班牙人源和羊源棘球蚴的大钩和小钩长度差异较大；与国内王虎[7]报道的青海细粒棘球蚴藏羊株和牦牛株的喙钩长度具有差异，与王光雷[15]及赵玲玲[16]报道的新疆和黑龙江地区的棘球绦虫成虫头节顶突上的大钩与小钩长度存在显著差异。

*** High significant difference P<0.000 1, **Slight significant difference P<0.001 9.图5 大钩与小钩的形态学参数统计学意义标示图Fig.5 Statistical figure of morphological parameters between large hooks and small hooks

A: TH and TW of large hooks (r=0.328 9); B: TH and TW of small hooks (r=0.488 2); C: TH and BL of large hooks (r=0.312 4);D: TH and BL of small hooks(r=0.625 9); E: TH and HL of large hooks (r=0.497 3); F: TH and HL of small hooks (r=0.577 3).

图6 大钩小钩的各形态学参数之间相关性分析图

Fig.6 Correlation analysis diagram of morphological parameters between large hooks and small hooks

表2 本研究测量及文献报道的大钩与小钩的长度
Tab.2 The length of large and small rostellar hooks from this study and literature references

文献/作者/宿主/虫期/地区Reference/Author/Host/Stage/Region大钩(μm)Largehook(μm)小钩(μm)Smallhook(μm)[7]/王虎/藏羊株/棘球蚴/中国青海24.8±1.620.6±1.3牦牛株/棘球蚴/中国青海23.64±1.519.15±1.7藏羊株/成虫/中国青海28.88±2.0422.95±2.84牦牛株/成虫/中国青海29.65±1.9521.33±2.55[11]/Yildiz/牛/棘球蚴/土耳其11～147～9羊/棘球蚴/土耳其9～156～12[12]/Layla/骆驼/棘球蚴/利比亚30.2923.69羊/棘球蚴/利比亚21.5816.29[13]/Ahmadi/人/棘球蚴/伊朗22.217.5/羊/棘球蚴/伊朗23.619.4[14]/Ponce/人/棘球蚴/西班牙21.9～23.919.3～20.3/羊/棘球蚴/西班牙23.7～25.420.7～22.4[15]/王光雷/家犬/成虫/中国新疆3628[16]/赵玲玲/家犬/成虫/中国黑龙江40～4530～38[N]/本研究/人/棘球蚴/中国辽宁11.04～13.777.88～11.81

3 讨 论

细粒棘球绦虫需要两个哺乳动物宿主才能完成生活史，一是终宿主：犬、狼、狐等食肉动物；二是中间宿主羊、牛、骆驼等偶蹄类，人也可作为细粒棘球绦虫的中间宿主。在一定的地理条件下，终末宿主和中间宿主间形成了较为固定的动物间循环关系链：森林型(北极型)，分布于较寒冷地带，以狼、犬和鹿之类的野生动物循环为特点；畜牧型，呈世界分布，以狼和偶蹄类家畜之间循环为特点。我国主要有绵羊/犬与牦牛/犬型动物循环链，其分布较广[17]。人体的感染是因误食细粒棘球绦虫的虫卵所致。虫卵经口进入人体，在十二指肠孵化出六钩蚴，六钩蚴侵入肠粘膜随血流到达肝脏，约经3 w左右发育为棘球蚴。细粒棘球蚴在发育过程中会形成上下两排喙钩，数量20～60个[18]。由于喙钩的形态学特征的变化依赖于原头蚴在其中发育的中间宿主的种类，通常情况下，幼虫的喙钩特征在成虫期明显保留，在不同的终宿主体内并无改变，喙钩的形态大小在不同的中间宿主传递过程中也基本保持不变，故可根据自然感染的终宿主体内寄生虫的喙钩特征，确定其从何种中间宿主获得感染，这对细粒棘球绦虫传播途径的确认提供了有力的判定依据[6]。

Rogan[8]、Antoniou[9]及Almeida[10]等研究阐明了鉴别大钩和小钩的基本方法。他们指出，棘球蚴原头节的上、下两排喙钩形态大小存在差异，上排的喙钩较大称为大钩，下排的喙钩较小称为小钩。两者在形态上区别为：大钩比小钩长径更长，整体略弯、形态更尖，相对小钩没有那么粗壮。另外，大钩有比较瘦窄的钩卫而小钩的钩卫则比较圆润和粗大，大钩柄突出部分表面光滑而小钩则有锯齿形边。本研究依据上述特征描述定义了所研究的大钩与小钩，通过计算机图像分析软件对所选取形态典型的喙钩进行了测量，获得了我国辽西地区人源细粒棘球幼喙钩形态参数。这些参数会对我国流行的棘球蚴病的形态学研究以及其流行病学调查与诊治提供参考依据。

Yildiz[11]及Ahmadi[13]等学者认为可以依据喙钩数量和喙钩的长度两个主要的特征参数来区别种属；Ponce[14]等学者认为大钩和小钩的总长是最合适的形态特征用来种属鉴定； Harandi[19]等研究指出喙钩的总长和刀长在种型鉴定上有一定意义；Harandi[20]近期的研究显示大钩和小钩的总长在G1和G6型间有差别；Layla[12]认为大钩的特征在鉴定种属上更具有特异性。检验和验证这些差异，可为区分棘球蚴的种类及种属朔源提供依据。本研究将本例测定的参数与国外学者报道的数据进行了对比，结果如表2所示，本例测得数据与Yildiz[11]报道的土耳其羊源和牛源棘球蚴测量的大钩与小钩数据结果较相近，与Layla[12]报道的利比亚的羊源和骆驼源、Ahmadi[13]报道的伊朗人源和羊源及Ponce[14]报道的西班牙人源和羊源棘球蚴的大钩和小钩长度差异较大；与国内王虎[7]报道的青海藏羊株和牦牛株棘球蚴喙钩长度具有差异，与王光雷[15]及赵玲玲[16]报道的细粒棘球绦虫成虫的大钩与小钩的长度也存在显著差异。表明来自不同地区、不同宿主的喙钩形态学参数确实存在明显差异，而这些差异的原因是否与前人[5-7,13,19]所述与该虫的基因型、寄生的中间宿主类型以及流行地区环境等不同有关，尚有待于进一步研究。

此外，本研究表明，采用CIAS对棘球蚴喙钩进行形态学观察测量，不失为检测棘球蚴或其他微小寄生虫的一种实用而方便的好方法。

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Morphological parameters of the protoscoleces hooks ofEchinococcusgranulosusderived from the human body

ZHANG Er-fu1,2, WANG Si1, DU Feng1, AN Chun-li1

(1.DepartmentofPathogenicBiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China;2.AnshanDiseasePreventionandControlCenter,Anshan114002,China)

To analyze the morphological parameters of protoscoleces hooks ofEchinococcusgranulosusderived from the human body and to provide the basis for the classification and epidemiology ofE.granulosus, hydatid cysts were isolated from liver of patient, and protoscoleces and the hooks were observed by light microscope. The parameters of the protoscoleces and the hooks were collected and measured using the computer image analysis system (CIAS). All of defined criteria data were calculated and analyzed statistically by the GraphPad Prism 5.0. Totally, 105 rostellar hooks were collected and measured, including 56 large hooks and 49 small one. The mean value of TL, TW, HL, BL of large hook respectively was 12.38 μm, 4.58 μm, 5.51 μm and 6.51 μm; the mean value of TL, TW, HL, BL of small hook respectively was 10.41 μm, 3.76 μm, 5.04 μm and 4.72 μm. These findings appeared that there was a significant statistical difference between the large and small hooklets (P<0.05). The morphological parameters of the hooklets of theEchinococcusgranulosusin local source and derived from the human were identified. The data is useful to classification and epidemiological studies onEchinococcusgranulosus.

Echinococcusgranulosus; derived from the human body; protoscoleces hook; morphology; computer image analysis system

An Chun-li, Email:cmucl@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.001

国家自然科学基金(No.81370189)

安春丽，Email：cmucl@126.com

1.中国医科大学基础医学院病原生物教研室，沈阳 110122；

2.鞍山市疾病预防控制中心，鞍山 114002

R383.3

A

1002-2694(2016)10-0855-06

2016-06-06；

2016-08-21

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81370189)