滇西横断山区家畜体表蜱类调查及鉴定

亚红祥，沈 姝，苏正元，邓 菲，张云智



滇西横断山区家畜体表蜱类调查及鉴定

亚红祥1，沈 姝2，苏正元2，邓 菲2，张云智1

目的 调查滇西横断山区家畜体表蜱的种类。方法 采集家畜体表寄生的蜱虫，经形态学鉴定后，用PCR法扩增蜱虫样本的16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2的基因片断，测序后进行序列分析。结果 共采集成虫蜱样本1 874只，经形态学鉴定为1科、1属(扇头蜱属Rhipicephalus)、4种，其中微小扇头蜱(R.microplus)1 637只(占87.35%))，镰形扇头蜱(R.haemaphysaloides)218只(11.63%)，短小扇头蜱(R.pumilio)11只(0.59%)，血红扇头蜱(R.sanguineus)8只(0.43%)。样品分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。系统发育树分析显示，微小扇头蜱Y2 16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2的基因序列分别与来自印度(EU918188)、贵州(KC503259)、马来西亚(KM246873)、贵州(KC503274)的微小扇头蜱在同一分支上，而与以往云南发现的微小扇头蜱不在同一分支；镰形扇头蜱Y5的 16S rRNA、12S rRNA和COI基因序列分别与来自泰国(KC170743)、台湾(DQ003005)和湖南(KM083593)的镰形扇头蜱在同一分支上；短小扇头蜱Y6和Y01 的ITS2基因序列与来自澳大利亚的短小扇头蜱(AF271282)在同一分支上。结论 滇西横断山区家畜体表蜱以微小扇头蜱为优势种，短小扇头蜱为云南境内首次发现。

蜱；PCR检测；序列分析；云南

蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，寄螨总目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。蜱目包括硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)，共计3科17属899种[1]。中国发现蜱类2科(硬蜱科和软蜱科)10属119种[2]。蜱是许多细菌、病毒、立克次体、螺旋体和原虫的传播媒介和贮存宿主, 携带病原体的蜱叮咬人或动物后，可致使人或动物发病[3]，所引起的这类疾病统称为蜱传疾病。近些年，我国相继发现了嗜吞噬细胞无形体[4]、新布尼亚病毒[5]、塔拉萨维奇立克次体[6]、劳氏立克次体[7]等新发蜱传病原体及其所致疾病。当前，蜱和蜱传疾病的危害已成为一个重大的社会公共卫生问题。云南省存在莱姆病、Q热、森林脑炎、巴贝西虫病等多种蜱传疾病[8]，最近有人在云南扇头蜱中发现了Nayun tick nairovirus、Nayun tick torquevirus等多种新病毒[9]，但对其媒介蜱的相关调查较少[10]。为了弥补此不足，本文在云南省西部横断山区进行蜱虫调查。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2014年5月在云南省大理州的家养动物体表采集蜱，魏山县采集473只、弥渡县85只，6月在云南省保山隆阳区的家养动物体表采集蜱1 316只，置液氮保存。

1.2 形态学鉴定 依据参考文献[11]分类检索表中的描述，在体视显微镜(SMZ-45T3，重光仪器有限公司)下进行形态学观察鉴定。

1.3 PCR检测 以生理盐水作为研磨液将经形态学鉴定的蜱种分别进行研磨，每份样品取60 μL研磨悬液，采用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒，按说明书操作提取总DNA。应用文献[12-15]中的引物及条件对样品的16S rRNA、12S rRNA、细胞色素C氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I，CO I)和核糖体DNA内转录间隔2(the internal transcribed spacers 2 of ribosomal DNA， ITS2)基因分别进行PCR扩增，目的基因片断大小分别为约460 bp、380 bp、660 bp、920～1 850 bp，引物由武汉擎科生物科技有限公司合成。PCR反应总体积为50 μL, 应用北京全式金生物技术有限公司2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行PCR扩增，以无菌水作为阴性对照，无阳性对照。PCR扩增时取2 μL被检样本DNA为模板，6 μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DL2000 DNA Marker 来自于大连宝生物公司。

1.4 DNA序列测定及分析 PCR阳性产物送武汉擎科生物科技有限公司进行序列测定。利用SeqMan软件拼接序列后，通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用“BLAST”工具和采用DNAstar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，并运用MEGA6.06软件Neighbor-joining法自展1000次构建系统发育树。

2 结 果

2.1 形态学鉴定 共计1 874只成虫蜱，经形态学鉴定为1科(硬蜱科Ixodidae)、1属(扇头蜱属Rhipicephalus)、4种(见图1)，其中微小扇头蜱(R.microplus)1 637只(占87.35%)，镰形扇头蜱(R.haemaphysaloides)218只(11.63%)，短小扇头蜱(R.pumilio)11只(0.59%)，血红扇头蜱(R.sanguineus)8只(占0.43%)。寄生于家畜水牛、黄牛、山羊、家犬体表最多的蜱种分别为微小扇头蜱(811只，占43.27%)、微小扇头蜱(712只，占37.99%)、镰形扇头蜱(160只，占8.54%)、镰形扇头蜱(26只，占1.38%)(见表1)。

注：A：微小扇头蜱(雄)；B：镰形扇头蜱(雄)；C：血红扇头蜱(雌)；D：短小扇头蜱(雌)A：R. microplus(male)；B：R. haemaphysaloides (male)；C：R. sanguineus (female)；D：R. pumilio (female)图1 四种扇头蜱Fig.1 Four species of Rhipicephalus

表1 滇西部分地区蜱类及其宿主动物的组成
Tab.1 Ticks and hosts in the west of Yunnan Province

微小扇头蜱(%)R.microplus镰形扇头蜱(%)R.haemaphysaloides短小扇头蜱(%)R.pumilio血红扇头蜱(%)R.sanguineus合计(%)Total水Buffalo811(43.27)18(0.96)11(0.59)0(0.00)840(44.82)黄牛Cattle712(37.99)14(0.75)0(0.00)0(0.00)726(38.74)山羊Goat100(5.34)160(8.54)0(0.00)0(0.00)260(13.88)家犬Dog14(0.75)26(1.38)0(0.00)8(0.43) 48(2.56)合计Total1637(87.35)218(11.63)11(0.59)8(0.43)1874(100)

2.2 PCR扩增蜱基因及序列分析 对经形态学鉴定的微小扇头蜱Y2、镰形扇头蜱Y5、短小扇头蜱Y6和Y01、血红扇头蜱Y11分别进行16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2基因片断扩增，结果样本Y2的4个基因片断均获得序列，Y5获得16S rRNA、12S rRNA、COI 3个基因序列，Y6和Y01获得ITS2基因序列，Y11的4个基因均测序失败。应用MegAlign软件将所获得的样本序列与GenBank中已知参考序列进行核苷酸相似性比较分析。

样本微小扇头蜱Y2的基因序列分析显示：16S rRNA基因序列与印度微小扇头蜱(EU918188)的相似性为99.8%，与中国云南微小扇头蜱(JX051062)的相似性为99.4%； 12S rRNA基因序列与中国贵州微小扇头蜱(KC503259)的相似性最高，为98.2%； COI基因序列与马来西亚微小扇头蜱(KM246873)的相似性为99.8%, 与中国云南微小扇头蜱(KF583579)的相似性93.8%；ITS2基因序列与中国贵州微小扇头蜱(KC503274)的相似性为100%, 与中国云南微小扇头蜱(KC203364)的相似性99.9%。

样本镰形扇头蜱Y5序列分析显示：16S rRNA基因序列与泰国镰形扇头蜱(KC170743)的相似性为99.4%，与中国台湾镰形扇头蜱(AY883868)的相似性为94.4%；12S rRNA基因序列与中国台湾镰形扇头蜱(DQ003005)的相似性最高，为95.4%；COI基因序列与中国湖南镰形扇头蜱(KM083593)的相似性最高，为99.8%。

样本短小扇头蜱Y6和Y01基因序列分析显示：两ITS2基因序列均与澳大利亚短小扇头蜱(AF271282)的相似性最高，分别为91.9%和92.0%。

2.3 系统发育树分析 根据蜱虫16S rRNA基因部分核苷酸序列进行系统发育树分析，结果显示Y2与印度微小扇头蜱(EU918188)在同一分支上，与中国云南微小扇头蜱(JX051062)不在同一分支上，表明Y2与印度微小扇头蜱的亲缘关系较近，而与云南微小扇头蜱的亲缘关系稍远；Y5与泰国镰形扇头蜱(KC170743)在同一分支上，与中国台湾镰形扇头蜱(AY883868)不在同一分支上，表明Y5与泰国镰形扇头蜱的亲缘关系较近(见图2)。

根据蜱虫12s rRNA基因部分核苷酸序列进行系统发育树分析，结果显示Y2与中国贵州微小扇头蜱(KC503259)在同一分支上，Y5与中国台湾镰形扇头蜱(DQ003005)在同一分支上，表明Y2与贵州微小扇头蜱的亲缘关系较近，Y5与台湾镰形扇头蜱的亲缘关系较近(见图3)。

根据蜱虫COI基因部分核苷酸序列进行系统发育树分析，结果显示Y2与马来西亚微小扇头蜱(KM246873)在同一分支上, 与中国云南微小扇头蜱(KF583579)不在同一分支上，表明Y2与马来西亚微小扇头蜱的亲缘关系较近，而与云南微小扇头蜱的亲缘关系远；Y5与中国湖南镰形扇头蜱(KM083593)在同一分支上，表明Y5与湖南镰形扇头蜱的亲缘关系较近(见图4)。

根据蜱虫ITS2基因部分核苷酸序列进行系统发育树分析，结果显示Y2与中国贵州微小扇头蜱(KC503274)在同一分支上, 与中国云南微小扇头蜱(KC203364)不在同一分支上，表明Y2与贵州微小扇头蜱的亲缘关系较近，而云南微小扇头蜱的亲缘关系远；Y6和Y01与澳大利亚短小扇头蜱(AF271282)在同一分支上，表明Y6和Y01与澳大利亚短小扇头蜱的亲缘关系较近(见图5)。

3 讨 论

云南以往已证实存在多种蜱传疾病疫源地，并已发现嗜吞噬细胞无形体、新布尼亚病毒、科罗拉多病毒等多种蜱传病原体的存在[8,16]。云南西部横断山区为国家级重要自然保护区，该地区山多、植被茂盛，地理环境复杂，与蜱传疾病相关的宿主动物和媒介节肢动物种类繁多，是恙虫病、斑疹伤寒、斑点热等多种自然疫源性疾病的主要疫源地[17-18]，然而该地区媒介蜱的相关调查工作较少。本次调查在水牛、黄牛、山羊和家犬四种家畜体表共捕获蜱虫1 874只，经形态学和分子鉴定为1科、1属(扇头蜱属)、4种，其中微小扇头蜱为该地区家畜体表蜱虫优势种。 微小扇头蜱的宿主动物有水牛、黄牛、山羊和家犬，其中寄生于牛的最多(占81.27%)。镰形扇头蜱的宿主动物有水牛、黄牛、山羊和家犬，短小扇头蜱和血红扇头蜱的宿主动物分别为水牛、家犬。

图2 根据蜱16S rRNA基因部分序列构建系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of partial segments of tick 16S rRNA gene

图3 根据蜱12S rRNA基因部分序列构建系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of partial segments of tick 12S rRNA gene

图4 根据蜱COI基因部分序列构建系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of partial segments of tick COI gene

图5 根据蜱ITS2基因部分序列构建系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of partial segments of tick ITS2I gene

蜱基因核苷酸序列发育树分析显示，微小牛蜱Y2的16S rRNA、12S rRNA、COI和ITS2基因序列分别与来自印度、中国贵州、马来西亚和贵州的微小扇头蜱在同一分支上，而与以往云南发现的微小扇头蜱不在同一分支，提示本次发现的微小扇头蜱Y2与印度、马来西亚和贵州微小扇头蜱的遗传进化关系较为密切，而与以往云南发现的微小扇头蜱的遗传进化关系稍远；镰形扇头蜱Y5的16S rRNA、12S rRNA和COI基因序列分别与来自泰国、台湾和湖南的镰形扇头蜱在同一分支上，提示本次发现的镰形扇头蜱Y5与泰国、台湾、湖南镰形扇头蜱的遗传进化关系较为密切；短小扇头蜱Y6和Y01的ITS2基因序列与来自澳大利亚的短小扇头蜱在同一分支上，表明本次检测的短小扇头蜱与澳大利亚短小扇头蜱遗传进化关系较近，但序列同源性仅在91.9%～92%。通过基因序列分析显示云南蜱种与国内外临近地区蜱种之间的亲缘关系较近，但它们之间存在一定的差异，具有区域差异性。

以往资料证实云南具有蜱类46种居我国首位，但没有短小扇头蜱的记录[11,19]。本次经形态学和分子生物学综合鉴定证实云南存在短小扇头蜱，该蜱为斑点热群中的劳氏立克次体的宿主[7]，斑点热病例在云南早已发现[18]，短小扇头蜱在斑点热等蜱传疾病的发生和传播中所起作用值得进一步研究。

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Tick species and genetic variants analysis of tick gene in Hengduan Mountains, west Yunnan Province, China

YA Hong-xiang1, SHEN Shu2, SU Zheng-yuan2, DENG Fei2, ZHANG Yun-zhi1

(1.YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention/YunnanProvincialKeyLaboratoryofNaturalFocalDiseaseControlandPrevention,Dali671000,China;2.WuhanInstituteofVirology,ChinaAcademyofScience,Wuhan430071,China)

To investigate the species composition and genetic variants of ticks in Hengduan Mountains of the western Yunnan Province, 1 874 individual ticks were captured from the body surface of domestic animals and were identified as four species of one genus of one family by species morpholog. Of them, 97.35% (1 637/1 874) of ticks wereRhipicephalusmicroplus, 11.63% (218/1 874)Rhipicephalushaemaphysaloides, 0.59% (11/1 874)Rhipicephaluspumilioand 0.43% (8/1 874)Rhipicephalussanguineus. The 16S rRNA, 12S rRN, COI and ITS2 segments of ticks were amplified separately by PCR and sequenced. Phylogenetic analysis showed thatR.microplusY2 (sample number) was in the same branch withR.microplusfrom Inida (EU918188), Guizhou of China (KC503259), Malaysia (KM246873) and Guizhou of China (KC503274) through 16S rRNA, 12S rRNA, COI and ITS2 sequences analysis respectively, but was differentR.microplusfomerly reported from Yunnan of China.R.haemaphysaloidesY5 was in the same branch withR.haemaphysaloidesfrom Thailand (KC170743), Taiwan (DQ003005) and Hunan of China (KM083593) through 16s rRNA, 12S rRNA and COI sequences analysis respectively.R.pumilioY6 and Y01 were in the same branch withR.pumiliofrom Australian (AF271282). It was concluded thatR.microplusis the dominant tick species of domestic animals in Hengduan Mountains,the west of Yunnan Province. In addition,

tick; PCR detection; gene sequence analysis; Yunnan Province

Zhang Yun-zhi, Email: zhanyunzhi1818@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.003

国家自然科学基金(No.81260437, No.81060132)；传染病预防控制国家重点实验室基金(No.2013SKLID302);科技基础性工作专项重点项目(No.2013FY113500)

张云智，Email: zhanyunzhi1818@163.com

1.云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室, 大理 671000；

2.中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071

R384.4

A

1002-2694(2016)10-0865-06

2016-05-11；

2016-07-05

R.pumiliomay be a new record in Yunnan.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260437 & 81060132), the Project of State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control (No. 2013SKLID302) and the Scientific and Technological Basis Special Project from the Minister of Science and Technology of the People’s Republic of China (No. 2013FY113500)