宁波地区耐多药结核分枝杆菌喹诺酮耐药gyr基因突变研究

车 洋，杨天池，平国华，林 律



宁波地区耐多药结核分枝杆菌喹诺酮耐药gyr基因突变研究

车 洋，杨天池，平国华，林 律

目的 为阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的gyr基因突变特征，深入研究MDR-TB对喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变特征的关系。方法 采用1%比例法对MDR-TB进行氧氟沙星药敏检测实验，通过 DNA直接测序法分析MDR-TB的gyr基因突变情况。结果 120株MDR-TB临床分离株中有34株对喹诺酮耐药，总耐药率为28.33%(34/120)。34株耐喹诺酮菌株中，30株gyr基因发生突变，突变率为88.24%(30/34)。30株gyr基因发生突变的菌株中gyrA基因突变有29株，占96.67%(29/30)，突变位点包括90、91和94位氨基酸；gyrB基因突变有2株，其中1株均合并gyrA基因突变，占6.67%(2/30)，突变位点包括499和502位氨基酸。结论 宁波地区MDR-TB对喹诺酮类药物耐药形势较为严峻，gyrA基因突变与MDR-TB对喹诺酮类药物耐药相关。

喹诺酮；gyrA基因；gyrB基因；耐多药结核分枝杆菌；耐药决定区

Supported by the Natural Science Foundation of Ningbo (No. 2015A610195) and the Public Health Detection Technology Laboratory of Zhejiang Province

耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的产生及传播加剧了结核病疫情，是目前结核病防控工作的重点和难点。由于同时对一线抗结核药物中抗菌活性最高的异烟肼和利福平同时耐药， MDR-TB治疗方案中作为核心药物的喹诺酮类的有效性就显得更为重要。喹诺酮类药物由于研发较早，抗菌效果好，且在临床上应用广泛，导致耐该类药物的结核分枝杆菌的产生。喹诺酮类药物药物机理主要是通过作用于细菌的DNA促旋酶，抑制细菌促旋酶活性干扰细菌DNA正常复制，导致细菌死亡[1-3]。目前的研究显示DNA促旋酶的编码基因gyr基因的突变是导致结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药的主要分子机制，突变区域位于喹诺酮耐药决定区(QRDR)[4-5]。本研究通过DNA直接测序对宁波地区耐多药结核分枝杆菌gyr基因突变情况进行分析，探讨本地区耐多药结核病喹诺酮类药物耐药产生与gyr基因突变的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 120例耐多药结核分枝杆菌临床分离株来源于2014-2015年宁波地区11个县(市)、区耐药监测期间收集的痰培养阳性菌株，按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》[6]相关要求，对培养阳性菌株进行菌种鉴定生化实验并采用1%比例法进行4种一线抗结核药物的耐药检测，对同时耐异烟肼和利福平的结核分枝杆菌确定为耐多药临床分离株。结核分枝杆菌H37RV标准株由中国疾病预防控制中心提供。

1.2 氧氟沙星药敏试验 所用氧氟沙星为Sigma产品，使用时按照厂家提供的纯度和效价计算用量，氧氟沙星在培养基的终浓度为2.0 μg/mL[7]。药敏试验所用培养基的配方、制备，操作步骤和结果判断等均参照《结核病诊断实验室检验规程》[6]。

1.3 DNA制备 采用CTAB法[8]，提取完成的DNA样本置-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增gyrA基因QRDR区：引物序列：F5′-TCGACTATGCGATGAGCGTG-3′，R5′-CG-ATGCGTAAACCGACCC-3′， 目的片段860 bpgyrB基因QRDR区：引物序列：F 5′-CCGCTGTGATCTCGGTGAAG-3′， R 5′-AGACCCTTGTACCGCTGAATG-3′，目的片段780 bp。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30次循环，72 ℃ 3 min。PCR反应体系：DNA模板1 μL(50 ng)，2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，上下游引物各 1 μL(20 mmol/L)， ddH2O 7 μL。

1.5 序列测定 PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.6 分析方法 使用MegAlign软件对基因测序结果进行分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行数据统计处理，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1gyrA和gyrB基因的PCR扩增结果 用Premier 5.0自行设计的引物扩增120例宁波地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株和H37RV标准株的gyrA及gyrB基因的QRDR区，扩增产物片段长分别为860 bp，780 bp(图1，图2)。

M: DNA marker; 1: negative control; 2-5: the clinical isolates; 6: H37RV.图1 PCR扩增gyrA基因的QRDR区Fig.1 PCR product of gyrA QRDRs

M: DNA marker; 1: negative control; 2-5: the clinical isolates; 6: H37RV.图2 PCR扩增gyrB基因的QRDR区Fig.2 PCR product of gyrB QRDRs

2.2 基因测序分析

2.2.1gyrA基因突变分析 H37RV标准株的gyrA基因未见突变。120株MDR-TB临床分离株的第95位点均由AGC→ACC。86株喹诺酮敏感菌株中有9株发生了gyrA基因突变，主要分布在90和94位(除95位外)；34株喹诺酮耐药株中有29株发生了gyrA基因突变，主要分布在90，91，和94位点(除95位外)，具体突变情况(表1)。

2.2.2gyrB基因突变分析 H37RV标准株的gyrB基因未见突变。120株MDR-TB临床分离株中有3株发生突变，2株为喹诺酮耐药菌株，突变类型为499位AAC→GAC(Asn→Asp)，502位AAG→CAG(Lys→Gln)，其中502位突变那株伴随gyrA 94位突变。1株喹诺酮敏感菌株gyrB基因突变类型为495位GCC→GCA(无义突变)。

表1 MDR-TB临床分离株gyrA基因突变特点
Tab.1 Characteristics of gyrA gene mutations of MDR-TB clinical isolates

2.3 耐多药结核分枝杆菌中喹诺酮耐药情况与gyr基因突变的关系 在34例耐喹诺酮的耐多药结核分枝杆菌中gyr基因突变30例，突变率88.24%(30/34)；在86例喹诺酮敏感的耐多药菌株中gyr基因突变10例，突变率11.63%(10/86)。耐多药菌株中喹诺酮耐药的菌株gyr基因突变率明显高于耐多药但喹诺酮敏感的菌株，两者之间差异有统计学意义(χ2=64.350，P<0.05)(表2)。

表2 耐多药菌株中对喹诺酮耐药情况及与gyr基因突变的关系
Tab.2 Relationship between quinolone resistant with mutations in the gyr gene in MDR-TB clinical isolates

喹诺酮类耐药情况quinoloneresistantgyr基因突变情况mutationofgyrgenes无突变(no)有突变(yes)总计totalχ2值P值喹诺酮类敏感resistant76108664.350<0.05喹诺酮类耐药susceptible43034

3 讨 论

就耐多药肺结核患者而言，二线抗结核药物是治疗的首选。由于喹诺酮类药物具备吸收效果好，不良反应小，价格便宜等优点已被WHO纳入耐多药结核病临床治疗的核心方案。但是随着该种药物的广泛使用，对该药物耐受的结核分枝杆菌产生并传播，给耐多药肺结核病疫情的防控及临床治疗效果带来了极大的影响。因此对耐多药结核分枝杆菌开展喹诺酮类药物耐药机制的相关研究对疫情的防控及临床化疗方案的合理制定都具有重要的意义。

本次研究显示，120例耐多药结核分枝杆菌中有34例对喹诺酮类耐药，耐药率高达28.33%(34/120)，提示本地区耐多药结核病对喹诺酮类药物耐药较为严重，这可能是由于本地区喹诺酮类药物的长期不合理应用所致。因此，在耐多药患者治疗前应先开展喹诺酮类药物的耐药性检测，根据实验结果再结合临床用药，有利于提高临床治疗效果，减少耐药产生。

结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的主要原因是药物作用靶位的改变，目前研究显示喹诺酮类药物作用靶位是细菌的DNA促旋酶编码基因gyr，该基因发生突变是喹诺酮类药物耐药最主要的分子机制，本次研究结果也证实了这一点：耐多药结核分枝杆菌菌株中喹诺酮类耐药的菌株中gyr基因突变率明显高于耐多药但喹诺酮类敏感的菌株，两者之间差异有统计学意义，这与相关研究一致[4-5]。根据研究资料显示，gyrA基因的突变频率在不同菌株间差异较大，据报道gyrA基因突变率最高达100%[9-10]，最低仅为10.3%[11]，国内相关研究显示gyrA基因突变率均在50%以上[12-17]，本次实验显示对喹诺酮耐药的耐多药菌株中gyrA基因突变率为100%(95位点均发生突变)，与国内研究相符。不同研究发现的gyrA基因突变类型存在较大差异，这种差异可能是由于耐药结核分枝杆菌菌株的基因型不同或不同的药物环境选择造成的。本次研究显示，120例纳入研究的耐多药菌株的gyrA基因95位点均由AGC突变为ACC，也进一步验证了gyrA基因95位点突变与基因的遗传多态性有关，而对喹诺酮类药物耐药关系不大。除了95位点外，gyrA基因突变株中，以94位点突变比例及突变类型为最多，这与相关研究结果相符[18-20]。

对gyrB基因突变导致喹诺酮类耐药的相关研究较少，有研究显示gyrB基因突变率及类型也相差较大[21-22]。本研究显示，对喹诺酮类药物耐药的耐多药菌株中，gyrB基因突变率仅为5.88%(2/34)，且1例发生gyrB基因突变的菌株伴有gyrA基因突变。gyrB基因的突变位点分布在495,499和502，与以往的研究报道完全不同。

综上所述，本地区耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药主要与gyr基因突变有关，且主要是gyrA基因发生突变，建议可通过对gyrA基因的快速检测来对喹诺酮类耐药情况进行预测。gyrB基因虽然也发生了一定比例的突变但不是喹诺酮耐药的主要分子机制对其进行检测仍存在一定的价值。针对gyrA基因95位的基因多态性及gyrB基因相对较高的保守性这些现象的深入探讨，有助于结核分枝杆菌的遗传分型研究。

[1] Shandil RK, Jayaram R, Kaur P, et al. Moxifloxacin, ofloxacin, sparfloxacin, and ciprofloxacin againstMycobacteriumtuberculosis: evaluation ofinvitroand pharmacodynamic indices that best predict in vivo efficacy[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(2): 576-582. DOI: 10.1128/AAC.00414-06

[2] Piersimoni C, Lacchini C, Penati V, et al. Validation of the agar proportion and 2 liquid systems for testing the susceptibility ofMycobacteriumtuberculosisto moxifloxacin[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 57(3): 283-287. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2006.08.018

[3] Peloquin CA, Hadad DJ, Molino LP, et al. Population pharmacokinetics of levofloxacin, gatifloxacin, and moxifloxacin in adults with pulmonary tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(3): 852-857. DOI: 10.1128/AAC.01036-07

[4] Ruiz J. Mechanisms of resistance to quinolones: target alterations, decreased accumulation and DNA gyrase protection[J]. J Antimicrob Chemother, 2003, 51(5): 1109-1117. DOI: 10.1093/jac/dkg222

[5] Morgan-Linnell SK, Becnel Boyd L, Steffen D, et al. Mechanisms accounting for fluoroquinolone resistance inEscherichiacoliclinical isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(1): 235-241. DOI: 10.1128/AAC.00665-08

[6] China Anti-tuberculosis Association Foundation Committe. Laboratory testing procedures for tuberculosis diagnosis[M]. Beijing: China education culture publishing House, 2006. (in Chinese)

中国防痨协会基础委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京：中国教育文化出版社，2006.

[7] World Health Organization. Policy guidance on drug-susceptibility testing (DST) of second-line antituberculosis drugs[S]. World Health Organization, Geneva, Switzerland, 2008.

[8] Van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, et al. Strain identification ofMycobacteriumtuberculosisby DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(2): 406-409.

[9] Takiff HE, Salazar L, Guerrero C, et al. Cloning and nucleotide sequence ofMycobacteriumtuberculosisgyrAandgyrBgenes and detection of quinolone resistance mutations[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38(4): 773-780. DOI: 10.1128/AAC.38.4.773

[10] Umubyeyi AN, Rigouts I, Shamputa IC, et al. Limited fluoroquinolone resistance amongMycobacteriumtuberculosisisolates from Rwanda: results of a national survey[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(5): 1031-1033. DOI: 10.1093/jac/dkm038

[11] Siddiqi N, Shamim M, Hussain S, et al. Molecular characterization of multidrug-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Patients in North India[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(2): 443-450. DOI: 10.1128/AAC.46.2.443-450.2002

[12] Zhao MC, Bao L, Wu YH, et al. Study on the gene mutation of quinolone-resistantMycobacteriumtuberculosisisolated from Sichuan Province[J]. J Sichuan Univ (Med Sci Ed), 2004, 35(3): 313-315. (in Chinese)

赵明才，鲍郎，吴悦涵，等.四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究[J].四川大学学报(医学版)，2004,35(3)：313-315.

[13] An HR, Wang W, Li HM, et al. Studies of gene of quinolone-resistant inMycobacteriumtuberculosisisolates by PCR-SSCP[J]. Chin J Antibiotics, 2005, 30(2): 103-106. (in Chinese)

安慧茹，王巍，李洪敏，等.结核分枝杆菌耐喹诺酮分子机制的研究[J].中国抗生素杂志，2005,30(2)：103-106.

[14] Huang TS, Kunin CM, Shin-Jung Lee S, et al. Trends in fluoroquinolone resistance ofMycobacteriumtuberculosiscomplex in a Taiwanese medical centre: 1995-2003[J]. J Antimicrob Chemother, 2005, 56(6): 1058-1062. DOI: 10.1093/jac/dki353

[15] Li HM, Jang P, Wang W, et al. Analysis of mutation of quinolonesgyrAgenes in silicotuberculosis[J]. Infect Dis Info, 2006,19(1): 28-29. (in Chinese)

李洪敏，姜平，王巍，等.矽肺结核病耐喹诺酮gyrA基因情况分析[J].传染病信息，2006,19(1)：28-29.

[16] Jang P, Wang GY, Feng B, et al. Analysis of mutation of quinolonesgyrAgenes in coal workers pneumoconiosis[J]. Chin J Ind Hyg Occup Dis, 2006, 24(2): 124-125. (in Chinese)

姜平，王国扬，冯柏，等.煤工尘肺结核耐喹诺酮类分离株gyrA基因突变的研究[J].中华劳动卫生职业病杂志，2006,24(2)：124-125.

[17] Wang JH, Li HM, An HR, et al. Analysis of the mutation on quinolonesgyrAgenes withM.tuberculosis[J]. Chin J Lab Diagn, 2008, 12(2): 175-177. (in Chinese)

王金河，李洪敏，安慧茹，等.分析结核病耐喹诺酮gyrA基因变化的规律[J].中国实验诊断学，2008,12(2)：175-177.

[18] Chan RC, Hui M, Chan EW, et al. Genetic and phenotypic characterization of drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in Hong Kong[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(5): 866-873. DOI: 10.1093/jac/dkm054

[19] Shi R, Zhang J, Li C, et al. Emergence of ofloxacin resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from China as determined by gyrA mutation analysis using denaturing high-pressure liquid chromatography and DNA sequencing[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(12): 4566-4568. DOI: 10.1128/JCM.01916-06

[20] Wang JY, Lee LN, Lai HC, et al. Fluoroquinolone resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates: associated genetic mutations and relations to antimicrobial exposure[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(5): 860-865. DOI: 10.1093/jac/dkm061

[21] Mokrousov I, Otten T, Manichva O, et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains from Russia[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(8): 2937-2939. DOI: 10.1128/AAC.00036-08

[22] Yin X, Yu Z. Mutation characterization ofgyrAandgyrBgenes in levofloxacin-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Guangdong Province in China[J]. J Infect, 2010, 61(2): 150-154. DOI: 10.1016/j.jinf.2010.05.001

Quinolone resistance andgyrgene mutations in multi-drug resistant ofMycobacteriumtuberculosisin Ningbo, China

CHE Yang, YANG Tian-chi, PING Guo-hua, LIN Lü

(NingboMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315010,China)

To analyze the characteristics ofgyrgene mutations in clinical isolates from the patients with multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) and the relation between MDR-TB with quinolone resistance andgyrgene mutations, the susceptibility of the MDR-TB clinical isolates to quinolones was tested by the proportion method. Thegyrgene mutations of MDR-TB strains were detected by PCR and the following direct DNA sequencing. Results showed that there were 34 strains with quinolone resistance in 120 MDR-TB clinical isolates. The quinolones resistance rate was 28.33%. There were 30 withgyrmutations in 34 MDR-TB with quinolone resistance. Of 30 quinolone resistant MDR-TB withgyrmutations, 29 mutated at condon 90, 91 and 94 ofgyrAgene. For 2gyrBmutations, 1 was associated withgyrAgene mutations. The mutations sites of gyrB were at condon 499 and 502 ofgyrBgene. This study shows that the situation of MDR-TB with quinolone resistance is very serious. The mechanism of quinolone resistance in MDR-TB is mainly in connection with the mutation ofgyrgene.

quinolone;gyrAgene;gyrBgene; multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosis; resistant determining

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.006

宁波市自然科学基金(No.2015A610195)、浙江省公共卫生应急检测关键技术重点实验室开放基金资助

浙江省宁波市疾病预防控制中心结核病防制所，宁波 315010

Email: chey@nbcdc.org.cn

R378.91

A

1002-2694(2016)10-0880-05

2016-06-06；

2016-08-11