弓形虫表面抗原SAG1基因自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性检测

郑丽娜，谭 峰，潘长旺



弓形虫表面抗原SAG1基因自杀性DNA疫苗的构建及免疫原性检测

郑丽娜1,2，谭 峰1，潘长旺1

目的 构建表达弓形虫表面抗原SAG1的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1并检测其免疫原性。方法 以弓形虫RH株基因组DNA为模板，PCR扩增SAG1基因(GenBank No.HM776940.1)，克隆至甲病毒复制子载体pDREP-eGFP中替换原有的eGFP基因，菌液PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。重组的自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1经股四头肌注射并联合瞬时电穿孔免疫BALB/c小鼠，同时以原质粒pDREP-eGFP作为对照组，间隔3周后以相同条件再免疫1次，收集小鼠血清，以弓形虫裂解抗原Western blotting检测其诱导产生的特异性抗体。结果 从弓形虫基因组中PCR扩增得到1 011 bp长度的SAG1基因，成功构建重组质粒pDREP-SAG1。Western blotting结果显示，重组质粒免疫的小鼠血清能特异性地识别虫体抗原中的SAG1抗原。结论 成功构建了弓形虫自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1，能诱导小鼠产生特异性的抗体，具有免疫原性。

弓形虫；SAG1；自杀性DNA疫苗

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种重要的机会性致病原虫，广泛寄生于人和多种动物的有核细胞内，可引起人兽共患弓形虫病，是免疫功能受损或免疫抑制者(如器官移植、艾滋病及恶性肿瘤患者)发生致死的主要病因之一。然而，由于弓形虫生活史复杂、传播途径多样、宿主广泛，临床上尚无理想的抗弓形虫药物[1]。研制安全、高效、廉价的疫苗被认为是弓形虫防治的重要措施[2，3]。

DNA疫苗是近年来发展起来的，堪称疫苗史上的一次巨大革命。DNA疫苗的诸多优势成为当前疫苗研究的热点，如制备简单、表达抗原以天然构象存在、能刺激机体产生免疫反应、易于制备多价疫苗、易于大规模生产、保存和运输[4]。尽管DNA疫苗具有良好的开发应用前景，但也存在转化宿主细胞基因组和引起免疫耐受的潜在风险[5]，对于它的临床应用无疑是一大障碍。基于甲病毒复制子的自杀性DNA疫苗，不仅具有传统DNA疫苗的诸多优势，而且克服了基因组整合和免疫耐受的弊端，因其甲病毒复制子的自我复制特性，使外源基因大量转录和翻译，同时产生的中间体双链RNA又可以诱导宿主细胞凋亡[6]。

SAG1是位于弓形虫速殖子表膜的重要抗原之一，具有较强的免疫原性，被认为是最有希望的弓形虫疫苗候选靶标[7]。本研究拟构建基于Semliki Forest(SFV)甲病毒复制子的弓形虫自杀性DNA疫苗载体pDREP-SAG1，并鉴定其在小鼠模型中的免疫原性，为弓形虫自杀性DNA疫苗的开发应用研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 虫株和细胞 弓形虫RH株由温州医科大学寄生虫学教研室保存；人包皮成纤维细胞hTERT由美国印第安纳大学医学院的William J. Sullivan教授惠赠。

1.1.2 质粒和菌株 SFV甲病毒复制子载体pDREP-eGFP[8]由瑞典卡罗林斯卡研究所的Peter Liljeström教授惠赠；大肠杆菌DH5α为温州医科大学寄生虫学教研室保存。

1.1.3 实验动物 BALB/c小鼠(6～8周龄，雌性，清洁级)由温州医科大学实验动物中心提供。

1.1.4 主要试剂 KAPA HiFi HotStart ReadyMix高保真酶购自美国KapaBiosystems公司；胎牛血清，DMEM购自美国Gibco公司；QIAamp○RDNA Mini Kit基因组提取试剂盒、QIAGEN Plasmid Maxi Kit质粒大提试剂盒购自德国QIAGEN公司；PCR产物回收试剂盒E.Z.N.A.○RCycle-Pure Kit和胶回收试剂盒E.Z.N.A. Gel Extraction Kit购自美国Omega bio-tek公司；限制性内切酶XmaI、SpeI和T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；PBS缓冲液干粉(pH 7.2～7.4)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 弓形虫基因组DNA的提取 将弓形虫速殖子感染人包皮成纤维细胞hTERT，培养于含1%胎牛血清的DMEM培养基中。待速殖子完全出胞后，用3 μm滤器过滤掉细胞碎片收集弓形虫。收集的虫体按照QIAamp○RDNA Mini Kit基因组提取试剂盒说明提取弓形虫基因组DNA，紫外分光光度法测度DNA浓度。

1.2.2 PCR扩增SAG1基因 根据GenBank中弓形虫SAG1基因编码序列(No.HM776940.1)，用Primer Premier 5.0软件设计1对引物。在上、下游引物5′端分别引入XmaI和SpeI酶切位点。上游引物: 5′-GGCCCGGG ATGTCGGTTTCGCTGCACCAC-3′ (下划线部分为Xma I酶切位点)；下游引物: 5′-GGACTAGTTCACGCGACACAAGCTGCGAT-3′ (下划线部分为SpeI酶切位点)。引物由上海立菲生物技术有限公司合成。PCR反应参数为：95 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 s，72 ℃退火延伸40 s，共32个循环；72 ℃终延伸2 min。取5 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余的20 μL PCR产物按PCR产物回收试剂盒进行纯化。

1.2.3 重组载体pDREP-SAG1的构建及鉴定 将上述SAG1片段和甲病毒复制子载体pDREP-eGFP分别用XmaI和SpeI双酶切。胶回收纯化片段，并将获得的SAG1基因片段与pDREP骨架大片段按3∶1摩尔比，用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布在卡那霉素LB平板上，挑取单克隆，经菌液PCR和双酶切初步鉴定后，送上海立菲生物技术有限公司测序验证。

1.2.4 动物分组及免疫 6只BALB/c小鼠随机分成2组，每组3只。第1组注射重组质粒pDREP-SAG1，第2组注射原质粒pDREP-eGFP设为对照组。质粒用QIAGEN Plasmid Maxi Kit质粒大提试剂盒提取后，用无菌PBS稀释到0.5 μg/μL，每只小鼠接种质粒100 μL，于两侧股四头肌下端进行肌肉注射，并立即用电转仪(ECM 830, 美国BTX公司)对免疫部位进行瞬时电击，电击参数为：75 V/cm 电击20 ms，间隔200 ms，脉冲6次。间隔3周以相同条件免疫1次，共免疫2次。

1.2.5 Western blotting检测免疫小鼠血清中特异性抗体 末次免疫后2周，采用眼内眦毛细管法取小鼠血清，用Western blotting鉴定小鼠血清中的特异性抗体。将弓形虫RH株弓形虫裂解抗原(TLA)[9]进行12% SDS-PAGE电泳，一抗分别为pDREP-SAG1免疫组混合血清和pDREP-eGFP免疫对照组混合血清，稀释比为1∶500；二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG 稀释比为1∶5 000。同时，以兔源β-tubulin抗体[10]为内参抗体，稀释比为1∶1 000；二抗为HRP山羊抗兔IgG。

2 结 果

2.1 SAG1基因的PCR扩增 以合成的1对引物，从弓形虫RH株基因组中扩增到SAG1基因片段，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1 011 bp处有1条特异的明亮的条带，与预期大小一致(图1)。

M: DNA标志物，1,2：SAG1基因，3：阴性对照M: DNA marker，1,2：SAG1 gene，3：Negative control图1 弓形虫SAG1基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of SAG1 gene

2.2 重组质粒pDREP-SAG1的构建与PCR、双酶切鉴定 质粒pDREP-eGFP用XmaI和SpeI酶切产生约11 000 bp的pDREP骨架大片段和720 bp的eGFP基因小片段。将SAG1基因的双酶切产物与pDREP骨架大片段连接，替换掉原质粒pDREP-eGFP上的720 bp长度的eGFP报告基因，产生重组质粒pDREP-SAG1。挑取平板上的阳性克隆用载体pDREP的通用引物进行PCR扩增可得到1 132 bp长度的单一条带，而原质粒pDREP-eGFP可扩增得到841 bp长度的单一条带，与预期大小一致。重组质粒经XmaI和SpeI双酶切鉴定，获得两条条带，分别是约11 000 bp的pDREP骨架大片段和1 011 bp的SAG1基因小片段，大小与理论值相符，并进一步送测序鉴定，重组质粒pDREP-SAG1构建正确(图2)。

M1,M2：DNA marker; 1: PCR amplification of pDREP-eGFP; 2,3: PCR amplification of pDREP-SAG1; 4: PCR amplification of SAG1 gene; 5: pDREP-eGFPdigested with Xma I and Spe I; 6: pDREP-SAG1 digested with Xma I and Spe I图2 重组质粒pDREP-SAG1的PCR(通用引物)和双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pDREP-SAG1 with PCR (universal primers) and restrictive enzymes digestion

2.3 Western blotting检测免疫小鼠血清中特异性抗体 重组质粒末次免疫小鼠后2周，收集小鼠血清。用弓形虫RH株虫体蛋白作为样品进行Western blotting检测。结果表明，重组质粒pDREP-SAG1免疫组血清能够特异性地识别弓形虫虫体蛋白中约30 kDa大小的SAG1蛋白，而原质粒pDREP-eGFP免疫组血清在30 kDa处未显示有特异性条带，同时两个泳道中的虫体蛋白在55 kDa处均能被弓形虫内参抗体β-tubulin识别到特异性条带，表明重组质粒pDREP-SAG1免疫小鼠后诱导小鼠产生了抗SAG1的抗体，具有较好的免疫原性。

1: Sera from plasmid pDREP-eGFP immunized mice; 2: Sera from recombinant plasmid pDREP-SAG1 immunized mice图3 免疫小鼠血清特异性抗体Western blotting检测Fig.3 Western blotting analysis of specific antibody in sera from immunized mice

3 讨 论

DNA疫苗是将编码病原体的抗原基因重组到真核表达载体中，通过皮肤、肌肉等免疫方式接种动物，使其在细胞内表达其编码的抗原蛋白。其中，自杀性DNA疫苗载体是近年来发展起来的基于甲病毒复制子一种新型DNA疫苗设计，具有自主复制、高效表达和诱导宿主细胞凋亡等特性，相比较常规DNA疫苗更为安全、高效，是近年来DNA疫苗领域的重大突破[6]。自杀性DNA疫苗在抗猪瘟病毒、流感病毒、人单纯疱疹病毒等病毒和肿瘤疫苗方面取得了令人鼓舞的结果[11]，但在弓形虫疫苗方面却很少有报道。

本研究选用的自杀性DNA疫苗载体pDREP[12]，是由Berglund等基于SFV甲病毒复制子改造的。pDREP载体除了常规DNA疫苗载体所含有CMV真核启动子、SV40转录终止信号和多聚腺苷酸尾外，其主要的特征结构是SFV复制子。SFV复制子由非结构蛋白(nSPs)和26S亚基因组启动子及结构蛋白组成。用外源的抗原基因取代SFV的结构基因构建自杀性DNA疫苗，疫苗进入细胞后转录表达出甲病毒的nSPs，nSPs介导RNA正负链的自我复制，从而使插入的外源抗原基因也得到大量的表达。Berglund等[12]发现自杀性DNA疫苗能够诱导比常规DNA疫苗更强的体液免疫和细胞免疫反应水平，这有利于解决大型动物免疫效果差、免疫剂量高等问题。同时，在自我复制过程中产生的大量的双链RNA(dsRNA)中间体，最终可诱导转染的细胞凋亡[8]，避免了常规DNA疫苗因整合宿主基因引发的隐患。

SAG1是目前研究较多的弓形虫抗原靶点，被证明具有良好的免疫原性和免疫保护性，据Henrik等报道用编码SAG1的DNA疫苗免疫小鼠后对强毒株RH株可提供80%～100%免疫保护力[13]。SAG1基因编码的蛋白，N端含有信号肽，有助于蛋白从胞浆运输到胞外；C端含有疏水区，被加工切去后，在C端加上一个糖脂锚使蛋白可以定位于膜上[14]。本研究扩增了SAG1基因全长编码区序列，包含N端信号肽和C端疏水区，表达的SAG1蛋白将以天然构象定位于细胞膜上，有利于APC细胞的摄取并诱导B细胞产生抗体，将比去除信号肽的细胞内型SAG1蛋白能更早地诱导抗体的产生[14]。

肌肉接种是DNA疫苗常用的免疫方式。相比较常规DNA疫苗通常需要100 μg的质粒，本研究只用5 μg的剂量，将自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1，采用肌肉接种并联合瞬时电穿孔[8]这种高效的质粒免疫方式免疫小鼠，结果诱导小鼠产生了抗弓形虫的特异性抗体，表明弓形虫自杀性DNA疫苗pDREP-SAG1具有免疫原性。

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Construction and immunogenicity of a suicidal DNA vaccine with surface antigen SAG1 gene ofToxoplasmagondii

ZHENG Li-na1,2, TAN Feng1, PAN Chang-wang1

(1.DepartmentofParasitology,SchoolofBasicMedicalSciences,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.SchoolandHospitalofStomatology,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China)

We constructed a suicidal DNA vaccine pDREP-SAG1 encoding the major surface antigen SAG1 gene ofToxoplasmagondiiand identify its immunogenicity. SAG1 gene (GenBank accession number: HM776940.1) fragment was amplified with PCR from genomic DNA ofT.gondiiRH strain. The PCR product was cloned into an alphavirus replicon-based vector pDREP-eGFP to replace the coding sequence of eGFP. Recombinant plasmid pDREP-SAG1 was confirmed by PCR, restriction enzymes digestion and sequencing. BALB/c mice were injected with the recombinant suicidal DNA vaccine pDREP-SAG1 intramuscularly into quadricep followed by immediate electroporation and boosted with the same condition once at 3-week intervals. Mice received injection with plasmid pDREP-eGFP were used as control. Sera collected from immunized mice were verified by Western blotting withToxoplasmalysate antigen (TLA). Results showed that SAG1 gene of 1 011 bp was amplified from genomic DNA ofT.gondii, and recombinant plasmid pDREP-SAG1 was successfully constructed. Sera collected from plasmid pDREP-SAG1 immunized mice could specifically recognize SAG1 antigen from TLA. The suicidal DNA vaccine pDREP-SAG1 was successfully constructed and showed its immunogenicity to induce specific antibody response in mice.

Toxoplasmagondii; SAG1; suicidal DNA vaccine

Pan Chang-wang, Email: wzpcw@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.007

潘长旺，Email:wzpcw@sohu.com

1. 温州医科大学基础医学院寄生虫学教研室，温州 325035；

2. 温州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，温州 325035

R382.5

A

1002-2694(2016)10-0885-04

2016-07-25；

2016-09-19

浙江省科技厅公益技术研究社会发展项目(No.2014C33161)、温州市科技局公益项目(No.Y20140665)和浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(No.2015R413061)联合资助

Supported by the Commonweal Project of Science and Technology Department of Zhejiang Province (No. 2014C33161) and the Commonweal Project of Science and Technology Department of Wenzhou City (No. Y20140665), as well as College Students Science and Technology Project and Xinmiao Talents Program of Zhejiang Province (No. 2015R413061)