雪菊黄酮对脂肪变肝细胞的降脂效果

方煊，李雅丽，陈新梅

（1.绍兴第二医院 普外科，浙江 绍兴 312000；2.新疆医科大学附属第一医院 VIP内科，新疆 乌鲁 木齐 830054；3.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）

雪菊黄酮对脂肪变肝细胞的降脂效果

方煊1，李雅丽2，陈新梅3

（1.绍兴第二医院 普外科，浙江 绍兴 312000；2.新疆医科大学附属第一医院 VIP内科，新疆 乌鲁 木齐 830054；3.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）

目的：研究雪菊黄酮对发生脂肪变的正常人肝细胞系L-02的影响。方法：医用脂肪乳注射液制备人肝L-02细胞的高脂细胞模型。以不同浓度（20、50、100 μmol/L）的雪菊黄酮进行共培养，分别孵育高脂变性的肝细胞不同时间（3、12、24、48 h）后，用油红脂肪染色法观察细胞脂滴形成情况。检测细胞培养上清内的酶学指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）及甘油三酯（TG）的含量。结果：医用脂肪乳培育人肝L-02细胞脂肪变性模型可行。高浓度的雪菊黄酮（100 μmol/L）培养后高脂肝细胞胞浆内脂滴明显减少，TG含量降低。不同孵育时间培育（3、12、24、48 h）后，TG含量随培育时间延长而逐步降低。结论：雪菊黄酮能降低脂肪变性肝细胞中TG的含量，作用效果与雪菊黄酮的作用浓度和培育时间相关，未见明显肝细胞酶学损害。

雪菊；黄酮；甘油三酯；高脂细胞模型

本课题组前期进行了雪菊黄酮的制备、成分分离鉴定和分析工作，并进行了小鼠调脂作用分析[1]，初步证明雪菊黄酮具有降低小鼠血脂的作用，其作用机制尚不清楚。前期研究主要采用的是动物模型，存在个体差异较大、实验条件不好控制、周期较长、材料耗费较多等缺点。而细胞模型实验不仅能针对性地研究细胞水平的脂肪肝发病机制，并且能精确控制用药浓度，研究分子作用机制，有效地缩短筛选治疗药物的进程，有助于筛选大量的药物。本研究采用脂肪乳作用于在体外培养的人正常肝细胞L-02细胞株的方式，建立脂肪肝的体外模型，结合油红O染色观察细胞内脂肪滴变化情况，来验证该肝细胞是否产生脂肪变性，并观察雪菊黄酮对脂肪变性肝细胞的作用，探索雪菊在高脂细胞模型上的作用及可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 雪菊黄酮 前期的研究[1]已完成了雪菊总黄酮提取物的制备和化学成分分析，通过对雪菊中主要成分的分离纯化，采用乙醇提取、大孔树脂精制工艺，获得了雪菊总黄酮提取物（CTTFE），并采用 HPLC/DAD建立了雪菊提取物的多波长定性和定量分析方法，采用核磁测试、液相质谱联用分析技术，鉴 定了雪菊中黄诺马苷（CT01）、马里苷（CT02）、奥卡 宁（CT04）等12种主要成分，其中10种主要成分为黄 酮类，化学结构见图1。

图1 雪菊黄酮的分离鉴定和主要成分

1.2 细胞培养方法 正常肝细胞株L-02培养到对数生长期，用6孔板接种，培养板内加入含5%胎牛血清、5%小牛血清的RPMI 1640培养液，细胞培养同时放入盖玻片，使细胞贴壁在盖玻片上附着贴壁生长。培养板放入饱和湿度孵育箱内培养，培养条件设置如下：温度为37 ℃，气体浓度为5% CO2。根据细胞生长情况，每2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.3 实验设计 接种L-02细胞在细胞培养板上，孵育24 h，待细胞贴壁生长后，设立实验组和高脂模型组，实验组又分为雪菊黄酮低、中、高3个不同浓度给药组（不同药物浓度分别为20、50、100 μmol/L），分别用含脂肪乳的RPMI 1640培养液培养，每组均设3个平行孔，培养3 d，实验重复3次。显微镜下观察细胞内脂滴形成状况。取细胞上清液，检测肝细胞分泌在上清中的肝脏酶学指标和甘油三酯（triglyceride，TG）。

1.4 细胞内脂滴形成的观察 将贴壁生长肝细胞的盖玻片从6孔细胞培养板中取出，清洗3次，采用固定液（4%多聚甲醛）固定20 min。清洗细胞2次，异丙醇漂洗数秒。室温下采用红色染料（油红O）染色10～15 min，蒸馏水终止染色，细胞内的中性脂肪可被染成桔红色或红色。显微镜下观察各组细胞内脂滴形成情况。

1.5 细胞酶学指标和TG测定 在细胞培养板的各孔中收集细胞培养上清液，在检验科自动生化仪上（BIO-RAD）定量测定细胞培养上清液中的代谢酶及TG含量。1.6 统计学处理方法 采用SPSS15.0统计软件进行分析。计量资料用±s表示，组间比采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪染色观察 雪菊100 μmol/L组脂肪染色后观察，在显微镜下看到胞浆内脂滴与高脂模型组比较明显减少，因此雪菊100 μmol/L组降脂效果最明显。各实验组细胞染色结果及分析结果见图2。

2.2 不同雪菊黄酮浓度对降脂效果的影响 雪菊黄酮配制成雪菊100 μmol/L组、雪菊50 μmol/L组、雪菊20 μmol/L组3个浓度后加入培养液，孵育48 h 后测定肝脏酶学指标和TG，统计结果见表1。

2.3 不同孵育时间对降脂效果的影响 雪菊黄酮孵育3、12、24、48 h后检测培养液体上清中TG，统计结果见表2。TG含量随雪菊黄酮作用时间延长而相应降低，在48 h效果显著（P＜0.01）。

3 讨论

雪菊是一种药食两用植物，又称为蛇目菊、双色金鸡菊，是新疆特色中草药[1-2]，原产北美洲，在我国新疆和田地区高纬度昆仑山北麓一带生长，新疆维医称作“古丽恰尔”（维吾尔语，意即花茶）[3]， 性味苦、辛，归肺、肝经。《本草汇言》称其可“破血疏肝，解疔散毒”。雪菊在新疆当地少数民族中作为茶饮使用多年，含有酮、生物碱、挥发性油、有机酸、皂井、氨基酸等多种药理成分，已成为营养学家、药理学家以及养生专家研究的热点[4-9]。我们前期试验采用柱层析法和质谱色谱联用技术已从雪菊中分离鉴定出多种黄酮类物质，发现黄酮含量 很高[1]，可有效地清除体内的氧自由基，防止细胞的退化、衰老及癌变的发生[10]，也具有免疫调节的作用，是降血压、降血脂、调节血糖、抗肿瘤与抗衰老相关药物中的重要元素[11-13]。上述研究资料表明，雪菊具有较为确切的降血糖、降脂、降压等功效，但一般采用雪菊提取物进行，缺乏对应的有效成分的分析和鉴定。此外，尚未见有关雪菊对非酒精性脂肪肝是否有保护作用的报道。

图2 细胞染色结果及雪菊作用后脂肪滴减少的镜下结果

表1 不同剂量雪菊黄酮对细胞培养液上清中酶学指标以及TG的影响（48 h）

表2 不同培养时间对细胞培养液上清中TG的影响

本研究探讨了脂肪乳作用于在体外培养的人正常肝细胞L-02细胞株建立高脂细胞模型的可行性，建立脂肪肝的体外中药筛选模型，结合油红染色观察细胞内脂肪滴变化情况，可以反映肝细胞产生脂肪变性的程度，并证实雪菊黄酮能够减少脂肪变性肝细胞的脂滴，降脂作用呈现时间和剂量依赖性，为雪菊的药物开发奠定了细胞学实验基础。

雪菊作为一种昆仑山特殊药用植物，在民间作为茶饮已经有多年历史，有一些观察描述性论述，但 大多数的研究仅限于验方使用，没有进行严格的雪菊化学单体分离鉴定，缺乏严格对照，本研究采用质谱连用的现代药物分离鉴定手段，对新疆雪线以上的雪菊进行单体分离，化学组分鉴定，在光谱和色谱测试指导下提取分离获取雪菊特征总提物，采用植物化学的研究方法对特征总提物进行分离，得到各单体化合物，并鉴定了主要单体化合物的结构，在体外培养体系中研究了雪菊降脂药效物质学基础和作用机制。该研究采纳了民间验方和维医为基础，有利于提高雪菊提取的标准化，有助于推动雪菊的物质学基础和药效学研究。

中药在治疗慢性病方面有独特的疗效，是我国传统医学的瑰宝，目前各种中药材都采用现代科学技术和方法证实药物的有效性，并阐明其作用机 制[14-17]。而本研究采用植物化学、工业色谱等技术和方法，筛选雪菊核心成分，并且阐明雪菊降低肝脏细胞脂肪的作用机制和作用靶点，能够提升地方特色药材雪菊开发利用的效率，为雪菊药物开发进行标准化生产奠定了实验基础。

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（本文编辑：赵翠翠）

Experimental study of flavonoids from Coreopsis tinctoria of lipid-lowering effect on liver cells

FANG

Xuan1, LI Yali2, CHEN Xinmei3. 1.Department of General Surgery, the Second Hospital of Shaoxing, Shaoxing, 312000； 2.Department of Internal Medicine VIP Ward, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, 830054； 3.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, 250355

Objective: To study the lipid-lowering effect of flavonoids from Coreopsis tinctoria on the liver cells with fatty degeneration. Methods: The medical fat emulsion injection was used as fat resource to make human liver fat cell model on normal liver cell line L-02. With different concentrations (20, 50, and 100 μmol/L flavonoids from Coreopsis tinctoria were co-cultured with hepatocytes with fatty degeneration and incubated for different times (3, 12, 24, 48 h). The oil red staining was used to mark the intracellular lipid droplets and morphological changes. The cell culture supernatants were collected to test triglyceride content. Results: L-02 high fat cell model was feasible. High concentration of flavonoids (100 μmol/L) showed the significant decrease of lipid droplets and lower triglyceride levels. The triglyceride decreased with prolonged incubation time. Conclusion: Flavonoids from Coreopsis tinctoria can reduce triglyceride in the liver cells with fat degeneration. There is no significant liver cell enzyme damage. The effect depends on the concentration and incubation time.

Coreopsis tinctoria； flavonoid； triglyceride； fat degeneration

R93

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.004

2015-11-02

国家自然科学基金资助项目（81460634）；山东中医药

大学2013年“名科工程”青年骨干培养计划课题（ZYDXY1337）； 新疆医科大学自然科学基金资助项目（2013ZRZD07）。

方煊（1976-），男，浙江绍兴人，副主任医师，硕士。

陈新梅，副教授，Email：xinmeichen@126.com。