糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡情况及潜在机制研究

赵洪庆，杜青，凌佳，杨琴，徐雅岚，王宇红

湖南中医药大学，湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208

糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡情况及潜在机制研究

赵洪庆，杜青，凌佳，杨琴，徐雅岚，王宇红

湖南中医药大学，湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208

目的研究糖尿病并发抑郁症（DD）大鼠海马神经元凋亡情况，探讨其可能的分子机制。方法采用高脂灌胃联合尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，随机分为糖尿病模型组和DD模型组，另取正常大鼠随机分为空白对照组和抑郁症模型组，抑郁症模型组和DD模型组继续给予28 d慢性不可预见性应激。造模结束后，采用Open-field实验和Morris水迷宫实验评价大鼠行为活动能力，HE染色观察大鼠海马病理改变，Western blot检测大鼠海马p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3蛋白表达。结果Open-field实验结果显示，各模型组大鼠自主活动能力显著下降，其中DD模型组大鼠较糖尿病模型组明显下降；Morris水迷宫实验结果显示，各模型组大鼠逃避潜伏期延长，其中DD模型组大鼠较糖尿病模型组明显延长；HE染色结果显示，DD模型组大鼠海马损伤最为严重；Western blot结果显示，各模型组大鼠较空白对照组p-JNK、Bax、Caspase8、Caspase3表达显著升高，Bcl-2表达显著降低，其中DD模型组差异更显著。结论基于糖尿病，DD引起海马神经元凋亡，其机制可能与细胞凋亡相关蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3等异常表达相关。

糖尿病；抑郁症；糖尿病并发抑郁症；神经元凋亡

糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）继发于糖尿病，具有危害大、自杀率高的特点。海马是与学习记忆密切相关的大脑组织，同时也是大脑中一个容易受到攻击的部位，其是脑内受糖尿病影响的首个组织，而且是抑郁症发生的首要部位。本课题组前期研究表明，糖尿病并发抑郁症的病变部位主要集中在大脑海马区，表现为海马神经元萎缩、凋亡、可塑性降低[1]。国内外研究表明，糖尿病与抑郁症均能引起不同程度的海马损伤，并且都与JNK信号通路的异常活化，导致凋亡相关蛋白的异常表达相关[2-3]。本实验通过HE染色观察海马神经元凋亡情况，Western blot检测海马p-JNK、Bcl-2、Bax、Caspase8、Caspase3蛋白表达，以糖尿病、抑郁症模型为对照，比较分析DD所致海马神经元凋亡的可能机制。

1　实验材料

1.1动物

7～8周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于室温（25±1）℃、相对湿度（50±5）%环境。

1.2主要试剂与仪器

链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司；兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗体，美国Santa公司；兔抗鼠p-JNK、Caspase3、Caspase8多克隆抗体，英国abcam公司；HRP标记的羊抗兔IgG二抗，武汉博士德公司；RIPA组织细胞快速裂解液，上海基尔顿生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，美国Thermo公司。One Touch Ⅱ血糖仪及血糖试纸（美国强生公司），动物行为学习记忆系统（Viewpoint），5417R冷冻离心机（Eppendorf），GS-6R离心机（Beckman），MK3型酶标仪（芬兰雷勃酶标仪公司），Mini Protean 3 cell电泳仪、凝胶成像分析系统（Bio-Rad）。

2　实验方法

2.1分组

50只大鼠随机分为2部分：其中20只作为空白对照组和抑郁模型组，每组10只；另外30只用于糖尿病造模。制备方法：14 d高脂饲料（20%猪油、20%吐温80、20%丙二醇、10%胆固醇、2%胆酸钠、0.2%丙硫氧嘧啶）饲养联合尾静脉注射STZ 38 mg/kg，造模3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，测定空腹血糖。去除造模过程中死亡大鼠，选取空腹血糖≥16.00 mmol/L大鼠为成模大鼠，并依据血糖值随机分为糖尿病模型组12只和DD模型组13只。

2.2造模及取材

空白对照组大鼠正常饲养，抑郁模型组大鼠采用慢性不可预见性应激的方法造模，慢性应激包括4 ℃冰水浴、45 ℃热刺激、电击、倾笼、噪音、潮湿垫料、昼夜颠倒、夹尾，每日采用1种刺激，同种刺激不连续使用，共28 d，期间大鼠均孤笼饲养。糖尿病模型组给予正常饮水饮食，DD模型组继续给予28 d慢性不可预见性应激，方法同抑郁症模型组。应激第24日开始对大鼠进行Morris水迷宫训练，每日1次，连续4 d，于第28日先对各组大鼠进行Open-field测试，测试结束进行水迷宫实验，记录各组大鼠逃避潜伏期时间，用以评价大鼠抑郁情况。行为学测试结束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，部分大鼠取脑组织保存于10%甲醛溶液中用于HE染色，剩余大鼠取海马组织于液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.3行为学检测

2.3.1Open-field实验测试所用敞箱为80 cm× 80 cm×40 cm，底面平均划分为25个小方格。实验前1 h将待测大鼠放入测试房间，测试期间关闭房间灯光，将大鼠从敞箱中央放入，观察并记录大鼠4 min内水平运动格数和垂直竖立次数。

2.3.2Morris水迷宫实验Morris水迷宫被均分为4个象限，平台置于西南象限水面下2 cm。造模24 d开始对所有大鼠进行水迷宫训练，训练时将大鼠从平台另侧面向池壁放入，2 min内找到平台则训练结束，未找到平台则将其引导至平台，停留数秒。连续训练4 d，于第5日进行水迷宫测试，记录大鼠逃避潜伏期。

2.4HE染色

取固定于4%甲醛溶液脑组织，常规石蜡包埋，切片，用二甲苯和梯度乙醇脱蜡水洗，洗后苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗至干净，经盐酸乙醇分化和自来水浸泡后置伊红液中2 min，100%乙醇脱水，二甲苯透明，加拿大树胶封固。

2.5Western blot检测

取冷冻保存的海马组织，每1 mg组织加入RIPA裂解液5 μL，冰上匀浆，离心制备组织蛋白提取液，BCA法测定其蛋白含量。根据目的蛋白分子量选择配制不同浓度的分离胶，上样，电泳，至溴酚兰抵达凝胶底时，停止电泳。采用湿转法将蛋白转移至NC膜上，37 ℃、5%脱脂牛奶封闭1 h后，裁剪目的蛋白所在的条带。将目的条带分别置于原位杂交袋中，加入相应的一抗（按说明书稀释），4 ℃过夜。TBST洗膜，然后加入稀释过的二抗（1∶1000），室温孵育1～2 h。TBST洗膜，ECL法进行显色。应用Image J图像处理软件对条带进行扫描，测量灰度值，计算各组目的蛋白的相对表达量。

3　统计学方法

4　结果

4.1Open-field实验结果

与空白对照组比较，各模型组大鼠自主活动数均明显减少（P＜0.01）；与糖尿病模型组比较，DD模型组大鼠自主活动数明显减少（P＜0.05）。结果见表1。

表1　各组大鼠自主活动情况比较（±s）

表1　各组大鼠自主活动情况比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与糖尿病模型组比较，#P＜0.05

组别 只数　活动次数空白对照组 10 48.3±9.3糖尿病模型组 10 18.4±6.3**抑郁症模型组 10 12.5±3.2**DD模型组 10　7.2±2.4**#

4.2Morris水迷宫实验结果

与空白对照组比较，各模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）；与糖尿病模型组比较，DD模型组大鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）。结果见表2。

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较（±s）

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与糖尿病模型组比较，##P＜0.01

组别 只数 逃避潜伏期/s空白对照组 10 16.87± 7.32糖尿病模型组 10 58.00±31.67**抑郁症模型组 10 76.70±14.73**DD模型组 10 79.82±16.32**##

4.3病理观察结果

空白对照组大鼠海马锥体细胞形态规则，排列整齐，细胞间隙正常；各模型组大鼠均可见海马椎体细胞排列紊乱，细胞间隙增大，胞体深染并呈一定空泡性损伤，其中以DD模型组大鼠海马损伤最为显著。结果见图1。

图1　各组大鼠海马组织病理形态（HE染色，×400）

4.4Western blot检测结果

与空白对照组比较，各模型组大鼠p-JNK、Bax、Caspase8、Caspase3表达显著升高，Bcl-2表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与糖尿病模型组比较，DD模型组大鼠Bcl-2表达明显降低，Bax、Caspase3表达明显升高（P＜0.05）；与抑郁症模型组比较，Bcl-2表达明显降低（P＜0.01）。结果见图2、表3。

图2　各组大鼠海马组织细胞凋亡相关蛋白表达免疫印迹电泳图

表3　各组大鼠海马组织各凋亡蛋白表达比较（±s）

表3　各组大鼠海马组织各凋亡蛋白表达比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与糖尿病模型组比较，#P＜0.05；与抑郁症模型组比较，△△P＜0.01

组别 只数　p-JNK　Bcl-2　Bax　Caspase8　Caspase3空白对照组 7 0.07±0.01 0.67±0.03 0.09±0.04　0.19±0.04 0.06±0.02糖尿病模型组 7 0.57±0.37**0.29±0.11**0.24±0.14**0.34±0.12**0.29±0.07**抑郁症模型组 7 0.61±0.26**0.38±0.07*0.31±0.06**0.38±0.08**0.34±0.11**DD模型组 7 0.74±0.40**0.15±0.01**#△△0.44±0.12**#0.49±0.21**0.46±0.07**#

5　讨论

研究表明，糖尿病大鼠伴有学习记忆功能受损，其与海马神经元损伤有关，抑郁模型大鼠存在明显的海马萎缩，神经元凋亡显著，神经营养低下等特点[4-5]。本课题组前期研究显示，DD大鼠海马神经元存在萎缩、凋亡、胞体肿胀等病理改变[1]，而DD是基于糖尿病产生的并发症，其对海马神经元的损伤与糖尿病、抑郁症可能存在相似且有差异的情况。

Open-field实验是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种常用行为学方法。实验结果表明，抑郁症大鼠与DD大鼠的自主活动和探索功能受到比糖尿病大鼠更为严重的损害。Morris水迷宫主要用于考察实验动物的空间学习记忆能力，广泛应用于与大脑海马组织病变相关的神经系统疾病研究。结果表明，与空白对照组比较，各模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，其中DD状态下大鼠空间学习记忆功能损害最为严重。Open-field实验和Morris水迷宫实验结果表明，DD大鼠行为学损害比糖尿病大鼠严重，而相比于抑郁大鼠则无明显的改变，说明DD是基于糖尿病对海马损伤的进一步加重，最终发展成抑郁状态。此外，各组大鼠海马病理观察结果显示，抑郁大鼠海马损伤比糖尿病大鼠严重，而DD大鼠海马损伤则比这2种模型大鼠均严重。

JNK激活在多种疾病介导的神经元凋亡过程中发挥重要作用。p-JNK可直接调节Bcl-2家族成员的活性，从而介导线粒体途径的细胞凋亡[6]。Bcl-2家族是目前公认与凋亡密切相关的基因，主要包括凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促进基因Bax等。抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax之间的比例能决定细胞是否发生凋亡[7]。Bax、Bcl-2蛋白能在线粒体完整性的基础上通过激活Caspase来调节细胞凋亡的发生[8]。其中，Caspase8起始于Caspase，在细胞凋亡过程中扮演着重要角色，Caspase3则是细胞凋亡过程中最关键的执行者之一。Western blot结果表明，p-JNK、Bax、Caspase8、Caspase3蛋白在各模型组中表达均显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2显著下降，表明糖尿病和抑郁症均能通过激活JNK调节各凋亡蛋白表达介导海马神经元凋亡。实验结果显示，DD模型组Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达较糖尿病模型组有显著变化，说明在糖尿病导致海马损伤的基础上，通过调控上述蛋白的表达进一步使海马损伤，进而并发抑郁症。与抑郁症模型组比较，除Bcl-2蛋白外，其他蛋白表达均无显著差异，说明抑郁大鼠海马神经元凋亡十分显著，与文献报道相符[9-10]。本实验结果表明，在糖尿病的基础上，DD引起的海马神经元凋亡机制可能与凋亡相关蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase8、Caspase3等异常表达有关。

综上所述，DD大鼠在行为学、海马病理以及凋亡蛋白表达各项指标上与正常大鼠和糖尿病大鼠均有显著差异。本研究表明，DD对海马的损伤是在糖尿病基础上进一步加重的，其与抑郁症造成的海马神经元凋亡无异，这也符合DD的临床发病规律。

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Study on Hippocampal Neuronal Apoptosis and Its Potential Mechanisms in Diabetic Rats with Depression

ZHAO Hong-qing, DU Qing, LING Jia, YANG Qin, XU Ya-lan, WANG Yu-hong
(Hunan University of Chinese Medicine, Training Bases, Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry, Changsha 410208, China)

Objective To study hippocampal neuronal apoptosis in rats with diabetes mellitus and depression (DD); To explore its potential molecular mechanisms. Methods High-fat fed combined with intravenous injection of STZ was used to establish the models of diabetic rats, and then the models were divided into diabetes group and DD group after modeling successfully. Normal rats were randomly divided into control group and depression group. Chronic unforeseeable stress was continuously given to depression group and DD group. Open-field test and Morris water maze were used to evaluate the behavior activity of rats in each group; HE staining was used to detect pathological changes in hippocampus of rats; Western blot was used to disclose the protein expression of p-JNK, Bax, Bcl-2, Caspase8, and Caspase3. Results Open-field test results showed that the independent activity of rats decreased significantly in each model group, which decreased significantly in the DD group; Morris water maze results showed longer escape latency in model rats, which increased obviously in DD group; HE staining results suggested that the damage of hippocampus was the most severe in DD rats. Western blot results showed that compared with normal group, the expressions of apoptosis protein of p-JNK, Bax, Caspase8, and Caspase3 in each model group increased significantly and Bcl-2 expression decreased significantly, among which the difference in the DD group was the most obvious. Conclusion Hippocampal neuronal apoptosis caused by DD is based on diabetes, which mechanism may be related to abnormal expressions of p-JNK, Bax, Bcl-2, Caspase8, and Caspase3.

diabetes mellitus; depression; diabetes mellitus with depression; neuronal apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.014

R228

A

1005-5304(2016)12-0055-04

国家自然科学基金（81373578、81403379、81573965）

王宇红，E-mail：wyh107@126.com

（2016-02-26）

（2016-03-19；编辑：华强）