果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

白广栋，王梦竹，王红岩，杨 雪，李明月，何倩毓

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)



果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

白广栋，王梦竹，王红岩，杨 雪，李明月，何倩毓*

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能，本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计，并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法，检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明：Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。

Cullin 3基因；双链RNA(dsRNA)；E3连接酶；RNA干扰；Real-time PCR

泛素化是蛋白质翻译后重要的一类修饰。蛋白质经泛素化修饰后最终通过泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)被降解。靶蛋白的泛素化降解一般是在E1活化酶、E2结合酶以及E3连接酶的共同作用下完成，其中对特定蛋白的降解主要是由E3连接酶决定。据目前研究发现，高等真核生物体内共存在1 000多种E3连接酶[1]，主要划分为两大家族，分别为HECT(Homologous to E6-AP C-Terminus)家族和RING(Realy Interesting New Gene)家族。由Cullin蛋白等组成的Cullin-RING E3 Ligases(CRL)复合体，便是RING家族中一员并占有相当大的比例。它通过降解生物体内的某些关键蛋白可以精细调控细胞中的许多信号通路和生理过程，如DNA复制、细胞周期、DNA 损伤修复、肿瘤抑制、生长发育、信号转导和转录调节等[2，3]。

CRL复合体是由含RING结构域的催化亚基(如ROC1、ROC2)、Cullin骨架蛋白、接头蛋白(如SKP1，ElongB/C，DDB1等)以及底物识别亚基(如F box，DCAF等)这4个部分组成。CRL复合体中所包含的Cullin骨架蛋白的不同决定了构成CRL的RING亚基、接头蛋白以及底物识别亚基的不同及特定的功能。在人体中共存在7种Cullin蛋白，分别是Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5及Cullin 7[4]。与其它Cullin蛋白不同的是，CRL复合体中的Cullin 3在与底物结合时不需要额外桥接蛋白，而是直接与底物识别亚基 BTB(bric-abrac tramtrack，broad complex)类蛋白相结合来介导底物的泛素化[5]。有研究表明，Cullin 3的异常变化会影响肿瘤相关信号通路从而影响肿瘤的发展[6]。Cullin 3的异常表达会影响小鼠和果蝇的生殖系统中精子的形成，这也可能是引起雄性个体不育的原因之一[7]。此外，Cullin 3可以降低引起假性醛固酮减少症2型综合征的无赖氨酸激酶蛋白的水平，还在维持血压、K+和pH的平衡中起着重要作用[6]。本实验利用果蝇这一成熟的模式动物，通过对其Cullin 3的dsRNA设计及RNAi效率检测，可为今后研究Cullin 3蛋白参与果蝇相关信号通路的研究提供技术支持。

1 材料

1.1 材料来源

果蝇Kc细胞由东北林业大学林学院邹传山老师实验室提供。使用添加5% 胎牛血清(Fetal bovine serum，South American Origin，Hyclone)的Schneider果蝇细胞培养基(Schneider’s Drosophila Medium 1X，liquid，Gibco，Invritogen)，在27 ℃生化培养箱中培养。当细胞密度达到106/mL时，以1∶5的比例转移到新鲜培养基。

1.2 主要试剂

T7体外转录试剂盒(由普洛麦格生物技术有限公司提供)；Real-time PCR试剂盒(由宝日医生物技术有限公司提供)；其余试剂为实验室常规所备试剂。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪、Real-Time PCR仪、DNA凝胶成像系统、低温冷冻离心机。

2 方法

2.1 dsRNA设计及引物合成

根据Flybase上发布的Cullin 3基因信息(Flybase ID：FBgn0261268)设计dsRNA。 dsRNA设计的原则：dsRNA长度在500 bp左右，且通过BLAST比对不能与果蝇基因组中其他基因有超过19 bp的同源性。根据确定的dsRNA合成区域的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0.软件设计Cullin 3的PCR引物以及对照基因EGFP的PCR引物，并在每一对引物的5’末端加上T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGG，作为最终PCR扩增引物。具体引物序列见表1。引物合成委托上海生工公司完成。

2.2 双链DNA的扩增

从果蝇Kc细胞中提取RNA，反转录成的cDNA为模板，分别进行Cullin 3、EGFP双链DNA的PCR扩增。使用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物凝胶分析后进行胶回收，并测序鉴定。鉴定成功后，每个基因的多管PCR胶回收产物进行浓缩，使其浓度达到合成dsRNA的要求。浓缩方法：将多管PCR胶回收产物合并一管后，加入0.1倍体积3 M 醋酸钠(pH=5.2)和1倍体积的异丙醇，混匀，置于冰上5 min后，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，弃上清，加500 μL预冷的75%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，干燥5 min后加30 μL无RNA酶污染的水溶解，-20 ℃保存待用。

表1 dsRNA合成引物序列信息及扩增产物

2.3 dsRNA的合成

以浓缩后的双链DNA为模板，采用T7体外转录试剂盒分别合成Cullin 3和EGFP的dsRNA，具体步骤按说明书操作并根据实际情况进行微调。

2.4 RNAi干扰实验

向12孔细胞培养板内以2×105密度接种果蝇的Kc细胞，12 h后，分别加入实验组Cullin 3和对照组EGFP的dsRNA，每组dsRNA的加入量均为5 μg/mL，每组3个实验重复，孵育48 h后，收集细胞。

2.5 Real-time PCR检测RNAi效率

分别收集各dsRNA处理的Kc细胞，提取RNA后并反转录成cDNA，稀释10倍后采用TOYOBO的SYBR Green Realtime Master Mix(TOYOBO，Cat.OPK-201)进行Real-time PCR。以果蝇rp49 作为内参基因，采用2-△△ct法分析目的基因的相对表达水平，每个样品重复进行3次，取各组数据的平均值和标准误，并将实验结果绘制成柱形图。表2为Real-time PCR涉及到的引物。

表2 Real-time PCR引物序列信息及扩增产物

2.6 统计分析

实验结果采用SPSS 16.0 “Independent Samples T-Test”分析。“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01。

3 实验结果

3.1 双链DNA扩增结果

以Kc细胞的cDNA为模板，利用表1引物进行PCR扩增合成双链DNA。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，获得图1所示特异性的目的条带。胶回收产物测序后BLAST比对确认为目的片段。

图1 Cullin 3基因以及EGFP基因dsRNA对应的双链DNA PCR产物电泳结果

3.2 dsRNA合成结果

以浓缩后的双链DNA为模板，利用T7 体外转录试剂盒分别合成Cullin 3-dsRNA以及EGFP-dsRNA，合成后的dsRNA稀释60倍使用1%琼脂糖凝胶进行电泳。通过凝胶成像系统分析得到如图2所示的特异的、与目的大小一致的单一条带。

图2 Cullin 3基因以及EGFP基因dsRNA电泳结果

3.3 Cullin 3基因dsRNA的RNAi效率检测及分析

为分析合成的Cullin 3-dsRNA是否有效，将dsRNA转入Kc细胞中，孵育48 h后收集细胞，提取RNA并反转录成cDNA后利用Real-time PCR检测Cullin3基因的表达。实验结果表明，Cullin3-dsRNA处理的Kc细胞中Cullin 3基因的表达显著下降(P<0.01)，与EGFP-dsRNA处理组相比较，其转录水平下降至15%(图3)。

图3 Cullin3 RNAi效率检测

EGFP、Cul3分别代表各自对应的dsRNA，柱形图上“**”表示差异极显著(P<0.01)

4 讨论

广泛存在于不同物种之间Cullin家族蛋白是保守的，其家族成员之一的Cullin 3蛋白也不例外。Cullin 3蛋白作为CRL复合体最重要的组成部分，参与调控机体内多条重要的信号通路，与血压、雄性生殖及肿瘤等疾病有一定的相关性，这也使其成为近年来诸多学者研究它的重要原因。目前，发表的文章认为Cullin 3通过参与NF-κB信号通路和NRF2(nuclear factor erythroid-2-related factor)信号通路的调节来调控肿瘤的发展与发生。NF -κB 信号通路有着调控细胞生殖、分化和凋亡的功能[8]。Cullin 3和KEAP1接头蛋白组成的特异结构可与IKKβ(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase B)结合，并介导IKKβ泛素化降解，从而激活了NF-κB 信号通路；NRF2信号通路可以调控抗氧化应激，从而维持细胞内的氧化还原平衡，由Culin 3组成的泛素-蛋白酶体系统可以介导NRF2核转录因子泛素化降解[9]。Lee和Shibata等人发现这两条信号通路影响着肿瘤的发生，这些发现为以后肿瘤的研究与治疗提供了基础[6]。

前人通过大量的实验证明了Cullin 3在肿瘤发展方面有着重要的意义。同时Cullin 3还在其它疾病的发生过程中有着重要的生物学功能，但具体是通过什么样的信号通路参与调控的，目前并不清楚。本实验利用果蝇这一成熟的模式生物，对它的Cullin 3基因进行dsRNA设计并利用体外转录方法获得对应的dsRNA，通过细胞RNAi技术和Real-time PCR方法检测其干扰效率。实验结果表明：Cullin 3基因的dsRNA具有显著的RNA干扰效果。此实验为日后研究Cullin 3基因的具体功能提供了一定的技术支持。

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[7] 田烨，赵涵，陈子江.Cullin蛋白在生殖系统中的研究进展[J].中国医学科学院学报，2013，01：125-128.

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2016-08-27

黑龙江八一农垦大学大学生创新创业项目(XC2015018)；黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动项目(XYB2015-07)。

白广栋(1994-)，男，本科。

E-mail：1584853964@qq.com

Q78

A

1005-2739(2016)06-0003-04

作者简介：何倩毓(1986-)，女，博士，讲师，研究方向为动物遗传育种。

E-mail：heqianyu2005@163.com