白腐真菌降解秸秆条件的研究

2016-12-15 06:59刘海霞
中国畜牧兽医文摘 2016年11期
关键词:木质素稻草含水量

刘海霞 张 力 叶 武

(江苏农牧科技职业学院 动物科技学院,江苏泰州 225300)

白腐真菌降解秸秆条件的研究

刘海霞 张 力 叶 武

(江苏农牧科技职业学院 动物科技学院,江苏泰州 225300)

本试验从温度、pH值、接种量以及秸秆中的水分含量等优化指标,研究白腐真菌发酵秸秆前后纤维素和木质素的变化。试验发现,在秸秆含水量为60%,温度在30℃,接种量为0.25g/kg,酸度控制在pH为5.0的条件下发酵7天的效果比较显著。本试验研究为白腐真菌处理秸秆饲料提供理论依据。

白腐真菌 秸秆发酵 饲料 单因素

我国年产各类农作物秸秆达5.7亿t,占世界秸秆总产量的20%~30%[1-2],但是,其中绝大部分并未得到充分利用,随着畜牧业的快速发展,饲料资源日趋紧张,开发利用秸秆饲料发展食草型、节粮型畜牧业不仅可节约饲料资源,而且可促进农业良性循环,合理有效地利用秸秆是饲料生产中的重要环节。本试验选取对秸秆降解效果较好的红芝(Ganoderma)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)两种白腐真菌发酵秸秆,通过改变培养基含水量、初始pH值、培养温度及菌种接种量,测定发酵前后秸秆纤维素和木质素的变化,研究不同单一因素对发酵秸秆效果的影响,为白腐真菌处理秸秆饲料提供理论依据。

1 材料

1.1 菌种

白腐真菌:红芝购自武汉食用菌栽培研究所,黄孢原毛平革菌由中科院北京植物研究所提供。

1.2 秸秆

稻草和小麦秸秆:将自然风干的秸秆粉碎、灭菌处理,过40目筛,备用。

1.3 培养基

1.3.1 PDA培养基(用于菌种保藏)

称取去皮新鲜土豆200 g,切成小块,加水至1 L,煮沸30 min。用纱布过滤后加20 g葡萄糖、20 g琼脂粉,在电炉上加热至琼脂溶化,加水补足1 L。分装至已空消过的试管中,置灭菌锅中121℃灭菌20 min。倾斜静置,待凝固后备用。

1.3.2 液体种子培养基(用于白腐真菌增富)

去皮马铃薯200 g,煮沸30 min,纱布过滤,加入20 g蔗糖,融化后补水至1000 mL,自然pH值,加入10 g秸秆粉,100 mL分装250 mL三角瓶,121℃间歇灭菌[3]。

1.3.3 固体培养基

水稻秸秆:麸皮=7∶3,(NH4)2SO41%,KH2PO4 0.2%,料水比=1∶4.5。每500 mL三角瓶含10 g培养基,121 ℃灭菌60 min。用于白腐真菌产酶[3]。

1.4 主要仪器

移液枪(Eppendorf公司);灭菌锅(上海博讯,YXQ-LS-100SII);无菌操作台(苏州净化;VS—1300U);分析天平(赛多利斯,TE214S);高温箱型电炉(上海博讯实业有限公司)。

1.5 药品

乙醚、乙醇、盐酸、硫酸、硼酸、氢氧化钠等常规分析药品。

2 方法

2.1 菌种活化

取4株斜面种子管分别接种于PDA培养基上,28 ℃倒置培养5 d。

2.2 液体培养

选取菌丝长势旺盛的平板,取菌苔前端接种于液体种子培养基,28℃恒温摇床(150 r/min)培养3~5 d,至长出可见的白色菌丝球,即可作为种子液使用。

2.3 发酵

将准备好的种子培养基和固体发酵培养基,每瓶按体积分数为10%的接种量接入菌种,25 ℃下静置培养。

2.4 不同培养条件对秸秆降解效果的影响

2.4.1 不同培养基含水量对秸秆降解效果的影响

调整固态发酵培养基中的含水量为60%、65%、70%,各10%的接种量接种红芝和黄孢原毛平革菌,在30℃,自然pH下,发酵稻草和麦秸20d,发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.2 不同培养温度对秸秆降解效果的影响

将秸秆基础固态发酵培养基,以各10%的接种量接种红芝和黄孢原毛平革菌,在25℃、30℃、35℃不同温度下,发酵稻草和麦秸20d,发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.3 不同菌种接种量对秸秆降解效果的影响

将秸秆基础固态发酵培养基,以总接种量分别为0.125g/kg、0.25g/kg、0.5g/kg接种红芝和黄孢原毛平革菌,在30℃,自然pH下,发酵稻草和麦秸20天,发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.4.4 培养基不同初始pH值对降解效果的影响

调节基础固态发酵培养基的初始酸碱值,使pH分别为4.0、5.0、6.0,在30℃下,发酵稻草和麦秸20d,发酵后测定纤维素、木质素含量。

2.5 结果计算

将培养好的秸秆培养基置于烘箱中,于 80 ℃烘干48 h,将样品编号,采用范氏(Van Soest)纤维测定法测定中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)含量[4],并计算中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的降解率。

中性洗涤纤维含量的计算:NDF(%)=(W1-W2)/ W×100;式中:W1-玻璃坩埚和NDF重(g),W2-玻璃坩埚重(g),W-试样重(g)

酸性洗涤纤维含量的计算:ADF(%)=(G1-G2)/ G×100;式中:G1-玻璃坩埚和ADF重(g),G2-玻璃坩埚重(g),W-试样重(g)

半纤维素含量的计算:半纤维素(%)=NDF(%)-ADF(%)

纤维素含量的计算:纤维素=ADF(%)-经72%硫酸处理后的残渣(%)

酸性洗涤木质素(ADL)含量的计算:ADL(%)=残渣(%)-灰分(硅酸盐,%)

3 结果与分析

3.1 培养基含水量对秸秆降解效果的影响

在固态发酵中,培养物的气体交换是影响白腐真菌对秸秆降解作用的重要因素之一,而气体交换量是由固、液相之比决定,

含水量过高或过低都会阻止白腐真菌的生长。

由表1看出,在含水量为60%的情况下,红芝和黄孢原毛平革菌对于小麦秸和稻草的木质素降解率最高,与65%和70%的含水量相比,差异显著(P<0.05)。因此确定发酵培养基的最适含水量为60%。

表1 培养基含水量对秸秆降解效果的影响(%)

3.2 温度对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同温度条件下对麦秸和稻草降解效果的影响,详见表2。

表2 温度对秸秆降解效果的影响(℃)

由表2看出,温度对于木质素降解率差异极显著(P<0.01),在30℃下,秸秆的木质素降解率最高,与其他温度相比差异显著(P<0.05),试验表明,温度高低影响固体发酵的进度和秸秆木质素的降解率。温度过高,发酵基中自腐真菌生长受到抑制,会降低秸秆木质素的降解率;温度过低,则会导致固体发酵的进度减缓。因此确定发酵培养基的最适发酵温度为30℃。

3.3 接种量对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同接种量麦秸和稻草降解效果的影响,详见表3。

表3 接种量对于秸秆降解的影响(g/kg)

由表3得知,菌种接种量在0.25g/kg时,秸秆木质素降解率最高,当接种量有0.125g/kg增加到0.25g/kg时,降解率显著升高,当接种量从0.25g/kg升高到0.5g/kg时,木质素降解率开始下降。在接种量较低时,菌丝在发酵基质上的生长点太少,对培养基中营养利用不够充分,菌种生长不好;当接种量超过一定量时,生长初期菌丝大量生长,需消耗大量营养,发酵基质中的营养物质大部分用于菌丝生长,而产酶阶段所需的营养物质利用受到限制。因此,接种量选择0.25g/kg较为合适。

3.4 pH对秸秆降解效果的影响

试验测试了不同pH对麦秆和稻草降解效果的影响,详见表4。

试验结果表明,pH在4.0的时候,秸秆木质素降解率最高。随着pH的增高,木质素的降解率减少。红芝和黄孢原毛平革菌适宜在微酸性环境内生长,其可在发酵早期产生有机酸,自腐真菌有较宽的初始pH范围。从图中可知,选择pH4.0最适合,木质素的降解率达到最高。

4 讨论

齐刚报道培养基初水分达到60%时,木质素降解率最高[5]。水分含量的增加有利于菌体对营养物质的输送,并且提高了酶的活性。水分含量过大时,严重降低了菌体对氧气的吸收和二氧化碳的排出,而且不利于发酵散发热量,引起蛋白质含量的减少。白腐真菌固体发酵秸秆时,水分含量过低会使菌丝的生长受到抑制,而水分过高又会影响氧气通入、产生的二氧化碳排出以及热量的散失,对菌丝的生长不利。本试验的数据显示,固体发酵秸秆的水分应控制在60%左右,以利于菌丝生长。

选择适宜的温度和酸度也会对木质素有影响,不同pH值会影响生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,从而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄,本试验的数据显示,固体发酵秸秆的温度应控制在30℃左右,有利于菌丝生长。红芝发酵稻草的木质素降解率达到26.52%,发酵麦秸的木质素降解率达到35.45%,黄孢原毛平革菌发酵稻草的木质素降解率达到28.19%,发酵麦秸的木质素降解率达到23.60%。大多数白腐真菌适宜生长在微酸性环境内,pH值在4.0~5.0之间。在pH为5.0时,最有利于白腐真菌漆酶的分泌。本试验的数据显示,固体发酵秸秆的pH应控制在5.0左右,以利于菌丝生长。

菌种接种量过高,会因菌体生长过快而产生过多的代谢废物,抑制白腐真菌的生长;接种量过低,菌体生长缓慢,培养时间长,使发酵时间延长[6]。本试验选择白腐真菌发酵7天,接种量为0.25 g/kg秸秆,木质素降解率最高,红芝发酵稻草的木质素降解率达到36.64%;发酵麦秸的木质素降解率达到34.74%,黄孢原毛平革菌发酵稻草的木质素降解率达到40.78%,发酵麦秸的木质素降解率达到37.76%。

通过单因素分析,得到以下结论:在秸秆降解过程中,秸秆的含水量、温度、菌种接种量、酸度的不同对白腐真菌的生长和秸秆木质素、纤维素的降解均有影响,秸秆的含水量为60%,温度在30℃,接种量为0.25g/ kg秸秆,酸度控制在pH为4.0的条件下发酵7天的效果比较显著。

[1] 饶辉.国内外秸秆类微生物发酵饲料的研究及应用进展[J].安徽农业科学,2009,37(1):159-161.

[2] 魏志文,赵士豪,李宝库.多菌株发酵秸秆饲料研究[J].安徽农业科学,2008,36(32):14108-14110.

[3] 费尚芬,鹿宁,刘坤,等.白腐菌纤维素酶高酶活菌株的筛选[J].安徽农业科学,2006,34(1):22-23.

[4] 张力,杨孝列.动物营养与饲料(第2版)[M].中国农业大学出版社,2012.

[5] 赵华,齐刚,代彦.酒糟和秸秆混合发酵生产蛋白饲料的研究[J].粮食与饲料工业,2004,(8):36-37.

[6] 唐媛,谢冰,吕宝一,等.白腐真菌处理难降解有机物的培养条件及应用研究[J].世界科技研究与发展,2008,30(1):60-65.

表4 pH对秸秆降解的影响

刘海霞(1974-),女,副教授,博士,研究方向为草食动物生产。

江苏省泰州市农业支撑项目(TN201518),江苏省大学生创新创业训练计划项目(201612806004Y),江苏农牧科技职业学院项目(NSFPT201506)

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