禽用DNA疫苗免疫效果增强的策略

衣伟萌　殷光文　黄驹辉　江和基　黄志坚（福建农林大学动物科学学院福建省动物药物工程实验室福州350002）

禽用DNA疫苗免疫效果增强的策略

衣伟萌殷光文黄驹辉江和基黄志坚*
（福建农林大学动物科学学院福建省动物药物工程实验室福州350002）

对于人和动物的传染病来说，DNA疫苗免疫是一种很有希望的免疫方式。经过25年的发展，已经上市的核酸疫苗仍屈指可数。禽用核酸疫苗一直是禽类疫苗的研究热点，文中描述提高核酸疫苗免疫效果的方式：接种途径，疫苗剂量及首免时间，增加宿主细胞对质粒的摄入，添加免疫增强分子，优化质粒骨架和密码子，疫苗抗原的选择，异源性的首免-加强免疫策略。

核酸疫苗禽类免疫途径

传统的禽用灭活疫苗或弱毒疫苗在抵抗禽类疫病方面发挥了重要作用，然而这些疫苗也存在着各种缺点。如制备储存运输困难，价格贵，在母源抗体或多种血清型病原共存的情况下不能产生很好的保护；一些活疫苗存在毒力返强的危险；很多疫苗不能区分自然感染和疫苗免疫［1-2］。核酸疫苗可以克服上述传统疫苗的不足，是一类很有希望的疫苗。核酸疫苗有载体和其表达的病原抗原组成，可以在动物体内产生体液免疫和细胞免疫应答；适于大规模免疫，安全、便宜，可以区分野毒感染；可以在常温下保存较长时间，储存运输方便；球虫核酸疫苗可以减少抗球虫药物的使用，进而减少肉类兽药残留［3-4］。

通常核酸疫苗免疫激发的保护性免疫应答效果有限，需要采取一些方法进行改善。需要考虑的方面如下：接种途径，疫苗剂量以及首免时间，增加宿主细胞对质粒的摄入，添加免疫增强分子，优化质粒骨架和密码子，疫苗抗原的选择，异源性的首免-加强免疫策略。

1　优化接种途径

大多数情况下，核酸疫苗通过肌肉注射的途径，尽管没有人对这种途径的免疫机理进行解释，但是一些研究人员进行了对比试验。对于裸露核酸，肌肉注射被认为是最有效的方式。质粒如果与微粒如聚乳酸-羟基乙酸共聚物或壳聚糖混合肌肉注射，通常比单独裸质粒注射效果要好。质粒如果通过大肠杆菌携带口服免疫，效果也通常优于单独质粒注射。当质粒被金颗粒包裹通过基因枪皮下注射时，效果要优于肌肉注射［5］。

2　质粒的剂量和加强免疫的影响

多数情况下，研究人员都会告诉免疫的剂量，但是通常都没有告诉选择这种剂量的依据。通常选择的剂量为50～200 ug质粒。有研究人员比较了不同剂量的效果，结果发现肌注剂量通常为25～200 ug［6］。有趣的是，一项研究发现，对于柔嫩艾美耳球虫，核酸疫苗肌注剂量25～50 ug的效果要好于100～200 ug；另一项针对禽流感病毒的研究发现，50～100 ug免疫剂量的效果要优于250 ug免疫剂量。对于蛋内免疫，40～60 ug通常是比较有效的剂量。口服免疫携带核酸疫苗的沙门氏菌，细菌的剂量也非常重要。一项研究发现，1011CFU的携带鸭肠炎病毒核酸疫苗的沙门氏菌免疫，效果优于低剂量的免疫。同样，109CFU的携带传染性法氏囊病病毒或柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的沙门氏菌免疫，效果优于107或108CFU低剂量的免疫［7］。

通常，一次剂量免疫往往不能激发较好的免疫应答。因此，需要加强免疫。对于禽流感病毒来说，加强免疫可以增加抗体的水平。对于禽巴氏杆菌和传染性法氏囊病病毒，通常需要一到两次加强免疫。当然，如果电击等方式被采用的话，免疫次数可以适当降低［8］。

3　初免鸡日龄的影响

因为肉鸡一般6周龄上市，所以肉鸡最好能够早点免疫，事实上肉鸡什么时候进行核酸免疫没有固定的标准，免疫日龄从18日龄鸡胚到孵化后5周～6周。初免日龄对于激发较好的免疫应答非常重要，一项在禽流感病毒上的研究发现，14日龄首免比1日龄首免要产生更高的抗体反应［9］。有研究人员指出，禽类的先天性免疫在幼龄鸡上发育不成熟。但是，7日龄的鸡肌肉细胞比14日龄的鸡更容易进行质粒转化。

4　增加宿主细胞对质粒的摄取

在哺乳动物上，注射的裸质粒很快就会被降解，这将降低疫苗的效力。因此，要在核酸疫苗降解之前让尽可能多的质粒被细胞摄取。在一些研究中，细胞转染的试剂会和核酸疫苗一起免疫动物，但是免疫效果增加多少并不清楚。

质粒摄取可以被机械地增加，可采用电击的方式增加质粒进入到细胞中。在禽上，电击可引起局部炎症反应，招募CD3+T细胞，增加体液免疫和细胞免疫的强度，而且质粒的浓度可以显著降到10 ug［10］。

此外，使用基因枪将包裹在金颗粒上的DNA注射到鸡的皮内，可以增加保护性免疫应答，质粒的量可降至1～2 ug。目前已有两种高压力的液体注射系统AgrojetTM和MedijectorTM被开发和使用［11］。

5　共注射免疫调节因子

免疫调节因子可以增加疫苗的效力。在禽上，共注射免疫调节因子是一种最经常被采用的增强疫苗效力的方法。大部分研究聚焦于鸡，少部分研究采用鸭做实验动物。在鸡上，IL2最常被用在核酸疫苗中。IL2可以增加抗体的产生，提高淋巴细胞的增值水平，提高CD4+T细胞的数量［12］。结合IL2的传染性法氏囊病病毒核酸疫苗免疫后，可以对该病毒的攻毒产生保护。添加IL2的球虫核酸疫苗免疫后，可以增加抗体的产生，改善鸡攻虫后的临床症状。IFN-γ和IL-15同样也被成功地运用，IFN-γ可以提高对球虫和新城疫病毒的保护；IL-15可以增加CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的水平，增加对禽流感病毒的体液免疫和细胞免疫水平以及对球虫感染的免疫保护［13］。CpG核酸序列可以被鸡TLR21识别，可以有效增强对传染性法氏囊病病毒和传染性支气管炎病毒的免疫保护作用。其他一些分子如IL-1、IL-4、IL-6、IL-17、IL-18、GM-CSF、IFN-α、CD145、TGF-β4、HMGB1、MDA5、LTB都有被用来增强禽用核酸疫苗的免疫效果。鸭上面的研究较少，IFN-γ、IL-2、CD154被用来增强对鸭乙型肝炎病毒的免疫保护效果［14］。

6　质粒骨架的优化和密码子优化

多数情况下，禽用核酸疫苗的载体和哺乳动物所用的载体类似。有部分研究人员选用pCAGGS质粒，其启动子是鸡的β肌动蛋白启动子，大多数情况下，这种质粒的效果没有与病毒CMV质粒进行比较。当与经典的质粒进行比较时，有两个研究结果相互矛盾，一项研究表明pCAGGS质粒针对流感病毒可以激发更高的抗体应答，另一项研究则恰恰相反［15-16］。

当把抗原的密码子优化成宿主偏好的密码子时，疫苗的效力可以得到提高，这在鸭上的一项流感病毒的研究中得到证明。对鸡的网状内皮组织增生病毒和传染性法氏囊病病毒的研究表明，抗原密码子优化和mRNA合成增加可以提高这两种病原核酸疫苗的免疫保护效果。

7　多种抗原共表达

多数情况下，研究人员用一种抗原进行免疫，往往可以激发较好的免疫应答。然而，鉴定具有很好免疫保护的抗原有时候并不容易。因此，也有采用两种或多种抗原研究核酸疫苗。在鸡上，合并鸡传染性法氏囊病病毒VP2、VP4和VP3可以激发比单抗原VP2更好的免疫反应［17］。同样，在鸡传染性支气管炎病毒、呼肠孤病毒、禽多杀巴氏杆菌等核酸疫苗免疫过程中，多抗原比单抗原的效果要好。有时候，为了激发交叉保护，需要把不同型病毒或细菌的抗原合并在一起免疫鸡，这在流感病毒和鸡传染性法氏囊病病毒中取得成功。

8　异源性的初免-加强免疫策略

单独一次核酸免疫有时候不能激发较好的免疫保护，需要在加强免疫时采用该抗原的蛋白疫苗或活载体疫苗，这就是异源性的初免-加强免疫策略。与在哺乳动物上的研究一样，禽上的研究也证明了该种策略在提高疫苗效力方面效果显著。在禽上，一般初免用DNA疫苗，加强免疫用蛋白疫苗或痘病毒活载体疫苗［18］。对于鸡传染性法氏囊病病毒，DNA初免-蛋白加强免疫可以对该病毒的攻毒感染产生100%的保护（用VP2抗原作为疫苗抗原）。对于球虫和流感病毒，该策略同样有效。在火鸡上，这种免疫策略对鹦鹉热衣原体感染可以提供一些保护。加强免疫用灭活的疫苗对于禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒的感染可以提供保护。对于鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、球虫病核酸疫苗，蛋内初免DNA免疫，而后加强免疫，也可以提高疫苗的效力。对于鸭乙型肝炎病毒，初免用DNA疫苗，加强免疫用痘病毒疫苗，显示对这种慢性病毒的感染有较好的治疗作用。

［1］Xia Yu，Renyong Jia，Juan Huang，et al.Attenuated Salmonella typhimurium delivering DNA vaccine encoding duck enteritis virus UL24 induced systemic and mucosal immune responses and conferred good protection against challenge［J］.Vet Res，2012，43：56.

［2］Jinjun Xu，Yan Zhang，Jianping Tao.Efficacy of a DNA vaccine carrying Eimeria maxima Gam56 antigen gene against coccidiosis in chickens［J］.Kor J Parasitol，2013，51（2）：147-154.

［3］Qianming Xu，Xiaokai Song，Lixin Xu，et al.Vaccination of chickens with a chimeric DNA vaccine encoding Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 induces protective immunity against coccidiosis［J］.Vet Parasitol，2008，156（3/4）：319-323.

［4］Dexing Ma，Mingyang Gao，Jie Li，et al.Construction of novel cytokine by fusion of chicken IL-2 signal peptide to mature chicken IL-15 and comparison of the adjuvant effects by DNA immunization against Eimeria challenge［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，156（1/2）：114-120.

［5］Vanrompay D，Cox E，Volckaert G，et al.Turkeys are protected from infection with Chlamydia psittaci by plasmid DNA vaccination against the major outer membrane protein［J］.Clin Exp Immunol，1999，118（1）：49-55.

［6］Suarez D L，Schultz-Cherry S.The effect of eukaryotic expression vectors and adjuvants on DNA vaccines in chickens using an avian influenza model［J］.Avian Dis，2000，44（4）：861-868.

［7］Suhua Wang.Efficacy of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimuriumagainst Eimeria tenella infection in chickens［J］.Int J Parasitol，2005，35（7）：777-785.

［8］Ogunremi O，Pasick J，Kobinger G P，et al.A single electroporation delivery of a DNA vaccine containing the hemagglutinin gene of Asian H5N1 avian influenza virus generated a protective antibody response in chickens against a North American virus strain［J］.Clin Vaccine Immunol，2013，20（4）：491-500.

［9］Kian-Lam Lim，Seyed Davoud Jazayeri，Swee Keong Yeap，et al.Antibody and T cell responses induced in chickens immunized with avian influenza virus N1 and NP DNA vaccine with chicken IL-15 and IL-18［J］.Res Vet Sci，2013，95（3）：1224-1234.

［10］Khawaja G，Buronfosse T，Jamard C，et al.Enhanced magnitude and breadth of neutralizing humoral response to a DNA vaccine targeting the DHBV envelope protein delivered by in vivo electroporation［J］.Virology，2012，425（1）：61-69.

［11］Srinivas Rao，Wing-Pui Kong，Chih-Jen Wei，et al.MultivalentHADNAvaccinationprotectsagainsthighly pathogenic H5N1 avian influenza infection in chickens and mice［J］.PLoS ONE，2008，3（6）：e2432.

［12］Kumar S，Ahi Y S，Salunkhe S S，et al.Effective protection by high efficiency bicistronic DNA vaccine against infectious bursal disease virus expressing VP2 protein and chicken IL-2［J］.Vaccine，2009，27（6）：864-869.

［13］Dexing Ma，Chunli Ma，Long Pan，et al.Vaccination of chickens with DNA vaccine encoding Eimeria acervulina 3-1E and chicken IL-15 offers protection against homologous challenge［J］.Exp Parasitol，2011，127（1）：208-214.

［14］Gares S L，Fischer K P，Congly S E，et al.Immunotargeting with CD154（CD40 ligand）enhances DNA vaccine responses in ducks［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13（8）：958-965.

［15］Yongping Jiang，Kangzhen Yu，Hongbo Zhang，et al.Enhanced protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector［J］.Antiviral Res，2007，75（3）：234-241.

［16］Suarez D L，Schultz-Cherry S.The effect of eukaryotic expression vectors and adjuvants on DNA vaccines in chickens using an avian influenza model［J］.Avian Dis，2000，44（4）：861-868.

［17］Jianrong Li，Yaowei Huang，Xueya Liang，et al.Plasmid DNA encoding antigens of infectious bursal disease viruses induce protective immune responses in chickens：factors influencing efficacy［J］.Virus Res，2003，98（1）：63-74.

［18］Haygreen E A，Kaiser P，Burgess S C，et al.In ovo DNA immunisation followed by a recombinant fowlpox boost is fully protective to challenge with virulent IBDV［J］.Vaccine，2006，24（23）：4951-4961.

Strategies to improve DNA vaccine efficacy of poultry

Yi Weimeng Yin Guangwen Huang Juhui Jiang heji Huang Zhijian*
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals，Fuzhou 350002）

DNA vaccination is a promising alternative strategy for developing new human and animal vaccines.The massive efforts made these past 25 years to increase the immunizing potential of this kind of vaccine are still ongoing.A relatively small number of studies concerning poultry have been published.In this review，strategies designed to improve DNA vaccine efficacy will be described∶influence of the route of administration，plasmid dose and age of birds on their first inoculation，increasing plasmid uptake by host cells，addition of immunomodulators；optimization of plasmid backbones and codon usage，association of vaccine antigens and finally，heterologous prime-boost regimens.

DNA vaccine Avian Routes

A

1003-4331（2016）05-0047-03

国家自然科学基金（31502058）、福建省教育厅科研项目（JA15159）、大学生创新项目（201510389029）资助。

衣伟萌（1995-），女，山东栖霞人，本科生，主要从事动物寄生虫病研究。Email：Yiweimeng11@163.com。

黄志坚（1963-），男，福建惠安人，教授，从事动物疾病防治与保健。E-mail：huangzj1999@sina. com。