河川沙塘鳢3个不同地理群体杂交F1代生长性能及遗传多样性

王佩佩，丁严冬，于兴达，贾秀琪，张国松，尹绍武，陈树桥，周国勤

( 1.南京师范大学 生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏 南京210023；2.南京市水产科学研究所，江苏 南京 210036 )

河川沙塘鳢3个不同地理群体杂交F1代生长性能及遗传多样性

王佩佩1，丁严冬1，于兴达1，贾秀琪1，张国松1，尹绍武1，陈树桥2，周国勤2

( 1.南京师范大学 生命科学学院，江苏省生物多样性与生物技术重点实验室，江苏 南京210023；2.南京市水产科学研究所，江苏 南京 210036 )

选取来自浙江建德、安徽当涂、江苏太湖3个不同地理群体的河川沙塘鳢，采用3×3完全双列杂交方式进行配组，对9个组合F1子代的生长性状及遗传多样性进行比较分析。通过对2月龄和4月龄F1子代的生长性状进行对比分析发现，建德(♂)×当涂(♀)杂交组合的全长增加率、质量增加率分别为42.58%、190.79%，建德×当涂(正反交)组合的全长杂交优势率、体质量杂交优势率分别为17.88%、66.75%，均高于其他组合。不同地理群体间的杂交F1子代的全长增加率、质量增加率、杂交优势率均高于同一地理群体间的自繁F1子代。采用8个微卫星引物分析获得9个组合F1子代的遗传分化指数平均值为0.195，表明9个组合子代间存在遗传差异与分化，其期望杂合度为0.1493～0.7971，观测杂合度为0.1562～1.0000。双列杂交子代的杂合度和遗传多样性高于自繁子代，其中建德(♂)×当涂(♀)组合的等位基因数、多态信息含量值分别为3.9和0.486，均高于其他组合。综合生长性能和遗传多样性，初步选择建德(♂)×当涂(♀)为最佳杂交组合。

河川沙塘鳢；地理群体；双列杂交；杂交优势；遗传多样性

河川沙塘鳢(Odontobutispotamophlia)属鲈形目、沙塘鳢科、沙塘鳢属，是我国特有的一种淡水底栖小型肉食性经济鱼类，广泛分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系[1]，其味美肉嫩、营养丰富，深受人们的喜爱。近些年，随着河川沙塘鳢野生资源的枯竭和市场需求的不断增长，该鱼已发展成为一个非常具有潜力的水产养殖新品种。然而，该鱼成鱼个体普遍较小，生长缓慢，无良种。因此，培育出生长快、高产、抗逆的优良品种是亟待解决的问题。

杂交育种作为最经典的一种育种方式被广泛应用于鱼类新品种的培育。迄今为止，已有较多关于水产动物杂交育种的研究报道，如马氏珠母贝(Pinctadamartensii)2个地理群体杂交子代在壳高、壳长、壳质量等方面表现出杂交优势[2]；建鲤(Cyprinuscarpiovar. jian)与黄河鲤(C.carpiohaematopterus)的反交F1子代为比较理想的养殖群体[3]，云斑尖塘鳢(Oxyeleotrismarmoratus)和线纹尖塘鳢(O.lineolatus)反交F1代在全长、体质量和生长指标方面具有明显优势[4]；长牡蛎(Crassostreagigas)3个选育群体完全双列杂交后代中多数杂交子代在生长性状上存在一定程度的杂种优势[5]。目前关于河川沙塘鳢不同地理群体间的杂交尚未见报道。本研究对浙江建德、安徽当涂、江苏太湖3个不同地理群体的河川沙塘鳢进行了3×3完全双列杂交，分析各杂交组合的增长率、杂交优势率及其遗传多样性，筛选出生长性状及遗传多样性优良的杂交组合，以期为河川沙塘鳢的杂交育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

亲鱼来源于建德新安江流域，安徽当涂县运粮河段和江苏苏州太湖东西山侧，亲本信息见表1。选取不同地理群体中形态标准、发育良好、健康无伤病的个体[全长(12.79±0.33) cm，体质量(32.25±2.48) g]作为繁殖亲本。

表1 河川沙塘鳢3个不同地理群体的亲本信息

1.2 试验方法

1.2.1 交配设计

选取建德、当涂、太湖3个地理群体的试验用亲鱼，在室内培育缸中暂养7 d后，按3×3完全双列杂交方式进行交配，每种组合选用10尾雄鱼和10尾雌鱼，交配方式见表2。

表2 河川沙塘鳢3×3完全双列杂交交配设计

1.2.2 人工繁育

设置9个培育缸，规格80 cm×40 cm×50 cm，培育缸内放专用鱼巢，每缸放10组亲鱼，水温(25±1) ℃，产卵2周后均孵出仔苗，每缸仔鱼1000～2500尾。仔苗以丰年虫(Artemiasalia)幼虫开口，当鱼苗达1.5 cm后足量投喂鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)水花，3 cm后足量投喂赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus)鱼苗。破膜一周后，每个组合随机选取约700尾幼苗放入桶中培育，培育桶直径100 cm，水位60～70 cm，每日观察鱼苗的存活情况，根据每个桶中鱼苗数量的变动，对其密度进行调整，使各组合鱼苗数量趋于一致[6]。鱼苗培育期间，保持各组合沙塘鳢幼苗生长环境基本相同。

1.2.3 数据测量

在F1子代培育至2月龄和4月龄时，从每个组合中随机选取120尾进行全长及体质量的测定，全长(自吻端到尾鳍末端)精确至0.01 cm，体质量精确至0.01 g。

1.2.4 DNA提取

从每个组合子代中剪取32尾个体的尾鳍，采用上海捷瑞生物工程有限公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，DNA样品存于4 ℃冰箱备用。

1.2.5 微卫星引物筛选及PCR扩增

从本实验室已开发的河川沙塘鳢微卫星引物中挑选出8个能稳定扩增的位点用于群体分析。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物位点的详细信息见表3。PCR扩增反应体系(20 μL)：灭菌水(7.4 μL)，2×Taq Mix(10 μL)，10 μmol/L正反引物(各0.8 μL)，模板DNA(1 μL)。PCR荧光扩增反应体系(10 μL)：灭菌水(5.79 μL)，2×Taq Mix(2.85 μL)，10 μmol/L正引物(0.04 μL)，10 μmol/L反引物和荧光引物(各0.16 μL)，模板DNA(1 μL)。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，32个循环，其中每个循环包括94 ℃变性30 s，退火温度30 s(各个位点退火温度见表3)，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像仪中观察是否扩增出目的片段且成单一条带，若有单一条带，则上样于ABI 3500 xl基因分析仪进行毛细管电泳，检测荧光信号并利用软件GeneMarker 1.97分析微卫星位点的片段长度。

1.3 数据处理及分析

1.3.1 体标数据处理

河川沙塘鳢F1子代全长增加率、质量增加率和杂种优势度量的计算公式为：

全长增加率/%=(L2-L1)/L1×100%

质量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

杂种优势值=F1-P

杂交优势率/%=(F1-P)/P×100%[7]

式中，L1和L2分别表示幼鱼2月龄和4月龄全长(cm)，m1和m2分别表示幼鱼2月龄和4月龄体质量(g)，F1为杂一代均值，即杂种组平均值，P为亲本种群均值，即亲本纯繁组均值。

试验数据均以平均值±标准差表示，试验结果通过Excel软件对原始数据进行初步整理后，用SPSS 17.0进行分析，在单因子方差分析的基础上采用Duncan′s多重比较检验组间差异，以P<0.05作为差异显著。

1.3.2 微卫星位点分析

利用POPGENE 1.32[8]分析微卫星位点的等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Nei氏遗传距离、遗传相似度、遗传分化指数和基因流；用PIC_CALC软件计算多态信息含量[9]。使用NTSYS软件进行聚类分析，以分析杂交群体之间的亲缘关系[10]。

2 结果与分析

2.1 生长性状分析

2.1.1 全长与体质量

分别对3×3双列杂交9个组合子代在2月龄，4月龄的生长数据进行分析，在2月龄时，9个组合子代的平均全长和平均体质量有差异，但差异不显著。4月龄时，建德(♂)×当涂(♀)组合子代的平均全长和平均体质量与其他组合相比呈现显著性差异(P<0.05)(表4)。

2.1.2 全长增加率、质量增加率、杂种优势

建德(♂)×当涂(♀)组合在全长增加率、质量增加率明显高于其他组合，杂交组和自交组之间具有明显的差异，杂交组普遍高于自交组，通过比较杂交优势率发现，全长杂交优势率依次为建德×当涂>当涂×太湖>建德×太湖，体质量的杂交优势率依次为建德×当涂>当涂×太湖>建德×太湖，建德×当涂组合的杂交优势率高于其他组合(表5)。

表4 河川沙塘鳢9个组合不同生长时期全长、体质量的平均值及多重比较

注：同一列中，相同上标字母表示差异不显著(P>0.05)，不同上标字母表示差异显著(P<0.05).

表5 9种组合的全长增加率、质量增加率、杂种优势率 %

2.2 微卫星分析

当涂(♂)×当涂(♀)、太湖(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×建德(♀)、建德(♂)×当涂(♀)、建德(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×当涂(♀)、当涂(♂)×建德(♀)、当涂(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×建德(♀)，其子代(分别命名为F1～F9)的遗传多样性信息见表6(包括各个位点在河川沙塘鳢9个组合子代的遗传多样性参数：等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量)。9个组合群体的多态信息含量为0.3410～0.4860，其中F4即建德(♂)×当涂(♀)组合的多态信息含量最高(0.4860)，期望杂合度为0.1493～0.7971，观测杂合度为0.1562～1.0000。8个微卫星位点在9个组合群体中均有多态性，多态信息含量从大到小的组合依次为F4>F7>F5>F6>F8>F1>F2>F9>F3。各基因座的基因流平均值为1.0317，遗传分化指数平均值为0.195(表7)，基因流与遗传分化指数呈负相关，根据基因流的大小，8个位点在9个组合之间存在一定程度的分化(4>基因流>1)，其中2个位点(OPRM123、OPRM200)遗传分化较大(基因流<1)，无遗传分化较小(基因流>4)的位点。用POPGENE 1.32软件对9个组合的遗传距离和遗传相似度进行分析(表8)。F1和F2两个组合之间的遗传相似度最高(0.9627)，F4和F8两个组合之间的遗传相似度最低(0.5158)。用NTSYS软件根据遗传相似度进行聚类分析(图1)。由图1可知，F1与F2，F8与F9先聚为一支，再与F7聚为一支；F3与F6聚为一支，再与F5聚为一支；F4单独聚为一支。

表6 9个河川沙塘鳢组合的遗传多样性信息

注：F1～F9依次为：当涂(♂)×当涂(♀)、太湖(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×建德(♀)、建德(♂)×当涂(♀)、建德(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×当涂(♀)、当涂(♂)×建德(♀)、当涂(♂)×太湖(♀)、太湖(♂)×建德(♀)；A，等位基因数；Ho，观测杂合度；He，期望杂合度；PIC，多态信息含量.

表7 河川沙塘鳢9个组合在8个微卫星位点上的遗传分化系数与基因流

表8 河川沙塘鳢9个组合的Nei氏遗传距离与遗传相似度

注：F1～F9同表6；对角线以上为遗传相似度，对角线以下为遗传距离.

图1 9个河川沙塘鳢杂交组合F1子代的聚类分析

3 讨 论

3.1 杂交育种及最优杂交组合分析

杂交育种是将不同品种和品系、不同种属之间以及不同地理群体之间的个体所表现出来的优良性状通过交配集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法，选择正确的亲本并建立合理的组合是杂交育种成败的关键。完全双列杂交是指将不同亲本之间进行所有可能的杂交[11]。本研究中，通过比较生长性状和遗传多样性发现，建德(♂)×当涂(♀)的杂交组合在全长增加率、质量增加率、多态信息含量上均高于其他组合，这与相关研究[12-13]相吻合，通过比较射阳、太湖、当涂、建德4个不同地理群体的河川沙塘鳢形态差异及遗传距离发现，建德群体与其他3个群体的形态差异最明显，亲缘关系最远，其中建德和当涂群体地理位置相对较远，因此，可能由于群体地理位置相距较远，基因交流较少，使得建德和当涂群体遗传差异较大[12]。通过对安徽当涂、江苏射阳、浙江余姚、福建闽江、江苏太湖群体的遗传多样性分析发现，当涂群体的遗传多样性最丰富[13]，因此建德和当涂群体杂交后代的遗传多样性越丰富，多态信息含量越高，在生长性状上的优势越明显，而这种优势在建德(♂)×当涂(♀)的杂交组合上的表现更为明显，因此可初步确定建德(♂)×当涂(♀)为最优杂交组合。

3.2 杂交F1子代的杂交优势分析

杂交优势在生物学中是一种很普遍的现象[14]。吴杨平等[15]通过对红壳文蛤(Meretrixmeretrix)双列杂交的杂种优势分析发现，杂交组的日生长率均大于自繁组，存活率优势更明显。强俊等[16]在吉富罗非鱼(GIFTOreochromisniloticus)与奥利亚罗非鱼(O.aureus)自繁与杂交F1遗传特性与抗病力分析中发现，杂交可以提高选育后代的抗病力。本研究中3个地理群体的杂交子代都出现了生长杂交优势，这与石斑鱼杂交一致[17]。杂交组合(建德×当涂、太湖×建德、太湖×当涂)在全长上的杂交优势率分别为17.88%、5.08%、6.95%，在体质量上的杂交优势率分别为66.75%、22.7%、32.5%，相比其他组合，建德和当涂群体的杂交优势最为明显。建德(♂)×当涂(♀)组合的全长增加率和质量增加率分别为42.58%和190.79%。研究结果显示杂交子代在生长性能方面优于自繁子代，而建德(♂)×当涂(♀)的杂交组合生长性能优于其他组合。

3.3 杂交F1子代的遗传多样性分析

遗传多样性就是生物所携带的遗传信息的总和，是生物多样性的重要组成部分。它是物种适应复杂环境、维持生存和进化的基础，一个物种的遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强。而微卫星标记与其他分子标记相比具有多态性丰富、共显性等优点，在鱼类的群体遗传结构的分析、鉴定遗传多样性以及图谱的构建等方面已得到应用[18]。微卫星位点的遗传变异程度可以用多态信息含量来描述，数值高则遗传变异大，反之则变异小[19]。根据Botstein等[20]提出的划分标准，在某一群体中，当多态信息含量>0.5时，该位点表现为高度的多态；当0.25<多态信息含量<0.5时，该位点表现为中度多态；当多态信息含量<0.25时，该位点表现为低度多态，本研究中的8个微卫星位点都表现出中度多态性，建德(♂)×当涂(♀)组合多态信息含量值最高，为0.486，说明该组合更具有选育的价值和开发潜力。遗传杂合度的大小反映了群体遗传变异的高低[21]，更适应环境变化和自然选择的生物群体，其杂合度越高[22-23]，本研究中测得的9个组合子代的期望杂合度和观测杂合度均较高，说明其遗传多样性较高，具有一定的育种潜力，而期望杂合度高于观测杂合度，可能是出现了无效基因[24]。通过分析9个组合在各位点的遗传分化系数和基因流发现，河川沙塘鳢F1子代在8个基因座的遗传分化系数均大于种群间无遗传分化的标准(遗传分化指数=0～0.05)[25]，各基因座的遗传分化系数均值为 0.1950，表示有19.5%的遗传分化来自不同组合之间，80.5%的遗传分化来自组合内，表明9个组合之间有一定程度的遗传分化，具有育种潜在的价值。

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GrowthTraitandGeneticDiversityintheF1ProgenyofDarkSleeperOdontobutispotamophilafromThreeDifferentPopulations

WANG Peipei1，DING Yandong1，YU Xingda1，JIA Xiuqi1，ZHANG Guosong1，YIN Shaowu1，CHEN Shuqiao2，ZHOU Guoqin2

( 1. College of Life Sciences, Key Laboratory of Biodiversity and Biotechnology of Jiangsu Province, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2. Institute of Fisheries Science of Nanjing, Nanjing 210036, China )

We chosed three different populations of dark sleeperOdontobutispotamophilafrom Jiande, Dangtu and Taihu and mated by using 3 × 3 full diallel crossing. The growth traits and genetic diversity about the F1offspring of nine combinations were compared and F1progeny′s growth traits were evaluated in 2 months and 4 months. The length growth rate and the weight gain rate of the Jiande (♂) × Dangtu (♀) combination were shown to be 42.58% and 190.79%. The overall length heterosis ratio and the weight heterosis ratio of Jiande×Dangtu (cross and reciprocal cross) combination were 17.88% and 66.75%, higher than those in other combinations. There were higer length growth rate, the weight gain rate and the heterosis rate in F1progeny from different geographic populations than those in the same geographical population of the self-reproducing F1offspring. Subsequently, the average value (0.195) of hybrid progeny genetic differentiation index (Fst) was figured out by using eight microsatellite loci, indicating that there were genetic differences and the differentiation of nine combinations existed in offspring. The nine combinations of expected heterozygosity (He) were ranged from 0.1493 to 0.7971 and the observed heterozygosity (Ho) ranged from 0.1562 to 1.0000. The heterozygosity and the genetic diversity of hybrid progeny were higher than those of self-reproducing progeny and the alleles (A). The polymorphism information content (PIC) value of Jiande (♂) × Dangtu (♀) combination were 3.9 and 0.486, higher than other combinations. To synthesize the growth performance and the genetic diversity, we suggest that determination of growth and genetic diversity of the Jiande (♂) × Dangtu (♀) be the preliminary best combination of cross breeding.

Odontobutispotamophila; geographical group; diallel cross; heterosis; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.012

S965.199

A

1003-1111(2016)05-0528-07

2015-11-18；

2016-02-29.

江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2013441)；江苏省六大人才高峰"高层次人才项目(2012-NY-032)；江苏省2015年度普通高校研究生实践创新计划项目(SJLX15_0300)；南京师范大学科技成果转化基金资助项目(2013-02).

王佩佩(1990—)，女，硕士研究生；研究方向：鱼类种质资源与遗传育种．E-mail：1032160631@qq.com．通讯作者：尹绍武(1969—)，男，教授；研究方向：鱼类种质资源与遗传育种. E-mail：yinshaowu@163.com．