油茶产黄酮内生真菌的发酵工艺优化

张婷

摘要 在单因素试验的基础上，采用正交试验法对油茶产黄酮内生真菌的发酵条件进行研究，结果表明，油茶产黄酮内生真菌Y-UH-2的最适发酵条件为：培养基起始pH值为7，接种量为5 %，培养温度为28 ℃，转速170 r/min，其黄酮产量为3.18 mg/100 mL，比未优化时高出42%。

关键词 黄酮产量；油茶；植物内生菌；单因素优化；正交优化

中图分类号 S794.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0260-02

Optimization of Fermentation Conditions of Flavonoids-producing Strain of Camellia oleifera

ZHANG Ting

（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen Hubei 448000）

Abstract The fermentation conditions of flavonoids producing strain of Cemellia oleifera were studied using orthogonal test，based on the single factor experments.The results showed that the optimum factors were as follow：the optimal intial pH value was 7，inoculation amount was 5%，the culture temperature was 28 ℃，fermentation speed was 170 r/min.The flavonoids yield was 3.18 mg/100 mL，improved by 42%，compared with the original state of strain Y-UH-2.

Key words flavonoids yield；Camellia oleifera；endophyte；single factor experments；the orthogonal test

植物内生真菌是指在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌，普遍存在于植物中[1]。由于内生真菌长期存在于宿主植物中，与宿主植物共同进化，能产生与宿主植物类似的活性物质，目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用[2]。油茶（Camellia oleifera），别名茶油树、茶子树、白花茶，常绿小乔木。油茶是我国独有的一种食用油料木本植物。茶油色清味香，营养丰富，且耐贮藏，是优质的食用油。另外，也可作为润滑油、防锈油用于工业。茶油中含有的不饱和脂肪酸高达90%，远高于菜油、花生油和豆油，与橄榄油相比VE含量高1倍，并且含有山茶甙等特定生理活性物质，具有相当高的营养价值。茶壳还是一种很好的食用菌培养基[3]。研究发现，油茶叶中含有多种黄酮类化合物，对这些黄酮类的获得方式主要依赖于提取[4]。本研究对前期获得的油茶产黄酮内生真菌的诱变菌株Y-UH-2进行发酵工艺优化，希望能为今后的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株。以油茶产黄酮内生真菌菌株的诱变菌株Y-UH-2为试验菌株。

1.1.2 培养基。采用PDA培养基[5]，培养基配制完毕后，高压灭菌锅121 ℃，20 min。

1.1.3 试剂。芦丁标准样品购自荆州昌华试剂公司，葡萄糖、琼脂、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、蔗糖、氯化钠、硝酸铵、硝酸钠、氯化钾、硫酸亚铁、乙酸乙酯等均为分析纯，购自武汉科普化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SHZ-3 循环水多用真空泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；JJ-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州金净净化设备科技有限公司；722s可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；DHWY-200B 恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；DH-600A 电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；100S-11高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵单因素优化试验。参照冷桂华等[6-8]的研究文献选取培养温度、培养基起始pH值、转速和接种量这4种单因素水平，如表1所示。

1.3.2 正交试验。结合单因素优化结果，选取4个单因素的各3个水平，如表2所示，用L9（34）进行正交试验设计。

1.3.3 黄酮含量的测定。按照沈建福等[9]的方法，测定一系列浓度不同的芦丁标准液的吸光值，绘制芦丁标准曲线。再根据芦丁标准曲线计算出黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 培养温度对发酵结果的影响。培养温度对发酵条件的影响如图1所示，温度会影响菌株的生长繁殖速度，从而影响其代谢物质的产量。当培养温度过低，仅20 ℃时，菌株生长缓慢，发酵密度降低，增加温度，菌株生长速度提高，但继续增加温度超过28 ℃时，温度过高影响了菌株的代谢过程，阻碍菌株中黄酮物质的积累，因此产黄酮含量少。在其他条件同等条件下，最适培养温度为28 ℃。

2.1.2 转速对发酵结果的影响。转速对菌株发酵产黄酮的影响如图2所示。当转速为100 r/min时，转速过低，影响溶氧效果，导致菌株生长缓慢，适当提高转速，菌丝生长状况得到提升，转速过高超过150 r/min时，导致菌体浓度下降，黄酮产量随之下降。因此，选择最适转速为150 r/min。

2.1.3 接种量对发酵结果的影响。当接种量为3%时，接种量少，菌株生长缓慢，黄酮产量偏低；增加接种量至5%时，黄酮产量随之增加，继续增加接种量，黄酮产量并没有继续增加，反而下降了，可能是接种量过大，营养不够，抑制了菌株的生长，使得黄酮产量也随之降低。因此，应该接入合适的菌量，使其快速生长。如图3所示，在其他条件不变的情况下，产黄酮内生真菌发酵最适接种量为5%。

2.1.4 培养基起始pH值对发酵结果的影响。在微生物生长过程中，pH值影响微生物的生长繁殖。适合pH值既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。因为发酵过程中pH值是不断变化的，所以起始pH值显得尤为重要。如图4所示，当pH值为5～7时，菌株发酵产黄酮产量逐渐上升，可能此时利用菌株生长，菌株发酵代谢产黄酮能力较强，再增加pH值，影响菌株的代谢过程，导致黄酮产量下降，因此选择最适起始pH值为7。

2.2 正交试验结果

在单因素试验结果上，进行正交试验，以黄酮含量为指标得到的结果如表3所示。极差显示RC>RB=RA>RD，由此可见，培养基起始pH值因素对发酵过程产生的黄酮含量有明显影响。表3显示发酵培养的最佳因素组合为A3B2C2D2。按照这个试验组合进行3组平行试验进行验证，黄酮含量分别为3.20、3.19、3.16 mg/100 mL，平均含量为3.18 mg/100 mL。均高于正交试验的任何一组，比未优化前诱变菌株Y-UH-2（2.24 mg/100 mL）高出42%（表4），这表明油茶产黄酮内生真菌的最佳发酵条件是转速 170 r/min，接种量为5 %，培养基起始pH值为7，培养温度为28 ℃。

3 结论

利用微生物发酵生产有价值的代谢产物时，培养条件如pH值、发酵温度等可变因子较多，因此在微生物培养时对培养条件的优化显得尤为重要。本试验结果表明产黄酮油茶内生真菌的发酵培养最佳条件是培养基起始pH值为7，接种量为5%，培养温度为28 ℃，转速 170 r/min，比未优化前产量提高了42%，高于张海龙等[10]在银杏中筛选出的产黄酮内生真菌的黄酮产量。在后续的研究中，还需进一步提高菌株产黄酮类物质的能力，为开启黄酮类物质获取的新途径提供试验依据。

4 参考文献

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[9] 沈建福，姜天甲.油茶壳中总黄酮的最佳提取工艺研究[J].中国粮油报，2008，23（3）：104-105.

[10] 张海龙，李善春，卢维浩，等.银杏内生真菌多样性与产黄酮类物质真菌的分离和鉴定[J].土壤，2015，47（1）：135-141.