HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

朱昱 顾玲玲 朱敏 张法标 方哲平

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

朱昱 顾玲玲 朱敏 张法标 方哲平

目的 构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法 通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因，构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体，经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果 PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论 本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体，可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。

基因 HGFK1 载体构建

HGFK1是肝细胞生长因子（HGF）第一个环状结构域（K1）的基因表达产物，由Xin等[1]在2000年首次被克隆于HGF的α链，是一个由79个氨基酸构成的球形结构。有研究表明，HGFK1可能通过表皮生长因子/表皮生长因子受体（EGF/EGFR）途径，抑制肿瘤血管生成、阻止肿瘤远处转移及拮抗HGF功能，并有效延长实验动物的生存期[2]。本研究通过克隆人HGFK1基因，构建其重组真核表达载体，转染至人肝癌HepG2细胞，观察HGFK1蛋白在HepG2细胞的表达，以期为研究HGFK1的生物学效应和肝癌的基因治疗打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料 克隆载体pGEM-T Easy（美国Promega公司），pcDNA3.1（-）真核细胞表达载体（美国Invitrogen公司），DNA Marker DL100（上海捷瑞生物工程有限公司），RNA提取试剂 Trizol（美国 Invitrogen公司），Lipofectamine 2000阳离子脂质体（美国Invitrogen公司）。T4DNA连接酶Taq DNA聚合酶（美国Thermofisher scientific公司），限制性内切酶XbaⅠ、HindⅢ（美国Thermofisher scientific公司），限制性内切酶XbaⅠ、HindⅢ引物（上海基康生物公司合成），兔抗人HGF抗体（武汉博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司），大肠杆菌菌株DH5a、pDC316-HGFK1病毒穿梭载体（浙江省台州医院中心实验室保存），人肝癌H ep G2细胞株（复旦大学附属中山医院肝癌研究所）。……