生石花植株离体再生及组培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 吕永平， 汪一婷， 李海营

(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州 310021)

Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

Note: Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).



生石花植株离体再生及组培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 吕永平， 汪一婷*， 李海营

(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州 310021)

[目的]建立生石花植株离体再生及组培快繁体系。[方法]以生石花成熟种子为外植体，研究生石花组培快繁技术。[结果]萌发后的幼苗在MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培养基上被成功诱导出愈伤组织；不添加6-BA的MS培养基有利于愈伤组织的分化，不定芽诱导率为4.65；在MS +0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培养基上不定芽增殖率较高，可达5.60。[结论]建立了生石花植株离体再生及快繁体系，有利于生石花种质资源保护和工厂化生产。

生石花；愈伤组织；离体再生；增殖；生根

生石花(Lithopssp.)为番杏科生石花属植物，原产于非洲南部、南非纳米比亚等极度干旱少雨的沙漠砾石地带。生石花变态叶肥厚，形如彩石，娇小玲珑，新颖奇特，享有“有生命的石头”的美称，成为众多爱好者收集莳养的观赏多肉植物[1-3]。生石花繁殖主要采用播种和分株方式，但其种子细小，生长速度缓慢，从萌发到开花至少需要3年；而分株方式繁殖率较低，实际生产栽培中使用较少[4-5]。此外，人类过度采掘和对其原产地生态环境的破坏导致生石花野生资源减少，这使其推广和应用受到很大限制。植物组织培养方法可以在短期内使植物快速繁殖，并缩短植物生长发育周期。目前对于生石花组织培养研究仍处于探索阶段，对其植株离体再生及组培快繁的研究鲜见报道[6-7]。笔者对生石花组培快繁技术进行研究，对于保存生石花种质资源和实现其规模化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料 细纹生石花(Lithopsgracilidelineata)的自交种子由浙江省农业科学院组培中心温室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒及接种。以生石花种子为外植体，将其置于2 mL PE离心管中进行消毒处理，先用洗洁精浸泡0.5 h后再用自来水清洗，然后在70%乙醇和有效氯浓度为1% 的次氯酸钠溶液中分别浸泡30 s和6 min，最后用无菌水冲洗3～5遍，每遍2 min (移液枪操作)。

将消毒处理后的种子在超净工作台中接种至MS基本培养基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH 5.8)上培养,待种子萌发后形成幼苗。

1.2.2 愈伤组织的诱导。将生石花幼苗转接至诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，诱导培养基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+6-BA 0.50 mg/L +NAA 0.05 mg/L，pH 5.8。

1.2.3 愈伤组织的分化。将诱导产生的愈伤组织接种至诱导培养基上进行愈伤组织的增殖，将愈伤组织接种至分化培养基上进行不定芽的分化。分化培养基： MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，添加不同浓度的6-BA(0、0.01、0.05、0.10 mg/L)，pH 5.8。每瓶接种4块愈伤组织，每组5瓶，35 d后观察愈伤组织的分化情况并统计不定芽的诱导率。培养条件：温度(23±2) ℃，光照强度40 μmol/(m2·s)，光照时间10 h/d。

1.2.4 不定芽的增殖。将愈伤组织分化产生的不定芽接种至3种增殖培养基上进行继代增殖培养，增殖培养基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，添加不同浓度的6-BA和NAA，pH 5.8。每瓶接种4个，每组5瓶，35 d后观察不定芽的诱导情况并统计增殖率。培养条件：温度(23±2)℃,光照强度60 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d。

1.2.5 壮苗生根及移栽。将增殖不定芽丛分割成单株后转接至壮苗生根培养基上培养。生根培养基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.10 mg/L NAA，pH 5.8。培养条件：温度(23±2)℃，光照强度60 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d。

将生根植株从培养基中取出并清洗后，置于阴凉通风处晾干2～5 d至表皮微皱，然后移栽至基质中。

1.3 数据处理及分析 不定芽诱导率=愈伤组织分化产生的不定芽总数/接种的愈伤组织总块数×100%。不定芽增殖率=增殖出的不定芽总数/接种的芽数×100%。

使用SPSS统计分析软件包(SPSS Inc, Chicago, USA)对数据进行显著性差异分析(LSD)。

2 结果与分析

2.1 6-BA浓度对愈伤组织分化的影响 接种14～28 d生石花种子陆续萌发，培养35～49 d成为幼苗(图1 A)。幼苗转接至诱导培养基上培养14～21 d形成黄绿色的愈伤组织(图1 B)，培养28～35 d更换新鲜培养基进行继代增殖，然后挑取生长状态较好的愈伤组织置于分化培养基上进行不定芽的诱导培养(图1 C)。培养35 d后，愈伤组织的分化情况见表1。由表1可知，愈伤组织在基本培养基A上培养时，不定芽的诱导率为4.65；在6-BA浓度为0.01 mg/L的培养基B上培养时不定芽的诱导率为2.80；随着培养基 C、D中6-BA浓度的升高，愈伤组织的分化率逐渐降低，生石花不定芽的诱导率降低。因此，6-BA的添加不利于生石花不定芽的诱导。

注：A. 生石花幼苗；B.愈伤组织的诱导；C.不定芽的分化；D.壮苗生根。Note: A. Young seedling; B. Callus induction; C. Differentiation of adventitious bud; D. Rooting culture.图1 生石花组培再生体系的建立Fig.1 Plantlet regeneration in vitro of L. gracilidelineata

Table 1 The effects of 6-BA concentration on the callus differentiation ofL.gracilidelineata

培养基Culturemedium6-BA浓度6-BAconcen⁃trationmg/L愈伤接种数Inoculationnumber∥个分化芽数Differentiationbuds∥个诱导率InductionrateA020934．65±1．03aB0．0120562．80±0．54bC0．0520341．70±0．37cD0．1020110．55±0．41d

注：同列不同小写字母表示不同培养基间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

2.2 不同培养基对不定芽增殖的影响 将在培养基A中分化出的不定芽丛分割成单株后转接至3种增殖培养基上培养，35 d后生石花不定芽的诱导情况见表2。由表2可知，不定芽在培养基E上的增殖率为3.85，在培养基F上的增殖率为5.60，且芽体生长健壮，而在培养基G中的增殖率仅为2.65，且部分增殖不定芽出现玻璃化现象。由此可知，培养基F是适合生石花增殖的培养基。

2.3 移栽成活率 将生石花的增殖不定芽丛分割成单株后转接至壮苗生根培养基上培养，35～56 d可获得健壮的生石花有根种苗，将生根植株从培养基中取出并清洗后，置于阴凉通风处晾干2～5 d至表面微皱，然后移栽至基质中进行栽培，移栽成活率可达90%以上(图1D)。

表2 不同培养基对生石花不定芽增殖的影响

注：同列不同小写字母表示不同培养基间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

3 结论与讨论

该研究通过愈伤组织间接再生途径获得了生石花的再生植株，并建立了生石花的快繁体系。结果显示，6-BA的添加不利于生石花愈伤组织的分化，而MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA是适合生石花增殖的最佳培养基，不定芽增殖率可达5.60,且植株生长健壮。将生石花的增殖不定芽丛分割成单株后转接至壮苗生根培养基上培养，35～56 d可获得健壮的生石花有根种苗，将生根植株从培养基中取出并清洗后，置于阴凉通风处晾干2～5 d至表皮微皱，然后移栽至基质中进行栽培，移栽成活率可达90%以上。

目前，研究者对生石花属植物的组织培养研究仅停留在获得无菌材料的水平，尚无建立生石花组培快繁体系的成功报道[6-7]。该研究建立了生石花植株的离体再生及快繁体系，对促进生石花种质资源保护和工厂化生产具有重要意义。参考文献

[1] HAMMER S.Lithops flowering stones[J]. Cactus & succulent journal,2005,77(4):194-195.

[2] 姚鸿年, 陆琰.生石花(续一)三、生石花的培植要点[J]. 中国花卉盆景,2008(1):22-23.

[3] 孙宁.播种生石花[J].中国花卉盆景,2012(6):24-25.

[4] 兑宝峰.生石花的栽培繁殖[J].中国花卉园艺,2006(24):14-16.

[5] 严霖, 罗清, 梁春,等.生石花属植物栽培繁殖[J].农业研究与应用，2016(2):78-80.

[6] 徐庆华, 范冬春. 多肉类植物试管微型花卉研究初报[J].农业工程技术(温室园艺),2009(9):62.

[7] 范丽楠, 张宗申, 刘平武.生石花种子萌发及幼苗生长最优条件的筛选[J].安徽农业科学,2016，44(18):123-126.

Plantlet Regenerationinvitroand Rapid Propagation ofLithopssp.

MOU Hao-jie, WANG Yan, LU Yong-ping, WANG Yi-ting*et al

(Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021)

[Objective] The aim was to establish plantlet regenerationinvitroand rapid propagation ofLithopssp. [Method] With mature seeds as explant, rapid propagation technique ofLithopssp. was studied. [Result] Calli were induced from the young seedling on MS medium+0.50 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA in this study. The results showed that the basic MS medium without 6-BA benefited the callus differentiation ofLithopssp., and the induction ratio of adventitious bud was 4.65; MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA was the optimal medium for the multiplication of adventitious bud, and the multiplication ratio was 5.60. [Conclusion] The plantlet regeneration and rapid propagation system ofLithopssp. were established, which has important guiding significance for the germplasm protection and industrial production ofLithopssp..

Lithopssp.;Callus; Regenerationinvitro; Proliferation; Rooting

引进国际先进农业科学技术计划(948)项目(2011-G31)；浙江省农业科学院青年人才培养项目(2015R21R08E08)。

牟豪杰(1977- )，男，浙江杭州人，助理研究员，从事植物组培产业化研究。*通讯作者，副研究员，硕士，从事生物技术方面的研究。

2016-10-12

S 604

A

0517-6611(2016)33-0143-02