人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

曲 莉 于晓风 徐华丽 睢大筼

(吉林省疾病预防控制中心，吉林 长春 130062)



人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

曲 莉 于晓风1徐华丽1睢大筼1

(吉林省疾病预防控制中心，吉林 长春 130062)

目的 观察人参皂苷Rb3(G-Rb3)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 100只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组及人参皂苷Rb3 7、14、28 mg/kg组。假手术组及模型组均腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 ml/kg，人参皂苷Rb3的3个剂量组分别腹腔注射G-Rb3 7、14、28 mg/kg，连续3 d。通过大鼠右侧大脑中动脉阻塞2 h，再灌注24 h，建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。缺血再灌注后6 h和24 h分别进行大鼠神经功能评分，于缺血再灌注24 h处死大鼠，取脑组织经TTC染色观察大脑梗死体积，检测脑组织中促炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。结果 人参皂苷Rb3 14、28 mg/kg均能明显改善大鼠神经功能评分，降低脑梗死体积(P<0.05或P<0.01)，可使血清中MDA含量明显降低，SOD和GSH-Px活性明显升高(P<0.05或P<0.01)，并降低脑组织中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05或P<0.01)。结论 人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用，其机制可能与抗炎及抗氧化应激有关。

人参皂苷Rb3；脑缺血再灌注损伤；炎症因子；氧化应激

人参皂苷Rb3(Ginsenoside Rb3，G-Rb3)是从西洋参茎叶二醇皂苷分离的主要单体皂苷，约占40%，化学名称：20(s)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-α-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其分子式C53H90O22，相对分子质量为1 078。人参Rb组皂苷系西洋参茎叶及根总皂苷提取的有效部位群，保证了人参皂苷Rb在组分(包括Rb1、Rb2和Rb3)及含量上的完整性。有文献报道，人参Rb组皂苷对多种实验性心肌缺血具有明显保护作用〔1～4〕，恰好与G-Rb3的抗心肌缺血作用相一致〔5～8〕。笔者前期研究发现，人参Rb组皂苷与G-Rb3对大鼠结扎双侧颈总动脉伴低血压所致实验性脑缺血均具有明显保护作用〔9,10〕。为确证G-Rb3对脑缺血的保护作用，本文建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，进一步观察G-Rb3对脑损伤的影响，为将G-Rb3开发成治疗脑缺血的中药一类新药提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物 清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重250～280 g，合格证号SCXK-(吉)2007-0003，吉林大学实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂 G-Rb3，吉林大学化学学院天然药物化学研究室提供，批号：20151205，纯度为98.5%，白色粉末，以0.9%氯化钠注射液配成所需浓度；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，批号：20160215；白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α测定试剂盒，北京康源瑞得生物技术有限公司提供，批号：20160110；TTC，美国Sigma公司，批号：20151011。

1.3 分组与给药 100只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组及G-Rb3 7、14、28 mg/kg组，每组20只。实验前每组动物腹腔注射给药，假手术组及模型组均腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 ml/kg，G-Rb3的3个剂量组分别腹腔注射G-Rb3 7、14、28 mg/kg，1次/d，连续3 d。

1.4 大鼠脑缺血再灌注损伤模型制备 末次给药1 h后，根据Longa等〔11〕提出的大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法制备模型：大鼠腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉(术前1 d晚禁食不禁水)，仰位固定于手术台上，颈正中切口，充分暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)，结扎右侧CCA近心端，CCA远心端和及ECA处挂线备用。将直径为0.225 mm的单丝尼龙鱼线线栓(鱼线一端为光滑钝球形，直径在0.35～0.45 mm之间，距球状端18～20 mm处涂有黑色标记)从右侧CCA距ICA分叉前2 mm处切口插入，缓慢向ICA入颅方向推进(18.0±2.0)mm，使鱼线头经过大脑中动脉(MCA)到达大脑前动脉(ACA)，从而阻断来源于同侧ICA、大脑前动脉和大脑后动脉的血流供应，即完成右侧大脑中动脉阻塞；分层缝合伤口，记录时间。2 h后提拉线头至CCA，实现对缺血脑组织的再灌注。再灌注后6 h和24 h分别进行大鼠神经功能评分。评分标准：无神经系统损伤体征为0分；不能完全伸展左前爪为1分；行走时向左侧转圈为2分；站立不稳，向左侧倾倒为3分；不能自发行走，并且意识丧失为4分。大鼠的神经评分越高，表示脑缺血损伤越严重〔12〕。再灌注24 h后，将每组10只大鼠断头，迅速取脑，置于-20℃冰箱20 min，取出并将大脑切成2 mm厚的冠状切片，放入5 ml TTC染液中，37℃孵育染色30 min，期间每7～8 min翻转一次切片，使其染色充分均匀〔13〕。染色成功后，将切片拍照保存，应用NIH ImageJ 软件测定梗死面积，并计算梗死体积百分比。另取10只大鼠腹主动脉采血，分离血清，按照SOD、GSH-Px及MDA试剂盒说明书，测定血清中SOD和GSH-Px活性及MDA含量；并检测脑组织中促炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平。

2 结 果

2.1 G-Rb3对大鼠神经功能评分的影响 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分于缺血再灌注6 h和24 h均有显著升高(P<0.01)；与模型组比较，G-Rb3 7、14、28 mg/kg组均能改善大鼠的神经功能损伤，显著降低神经功能评分(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2 G-Rb3对大鼠脑梗死体积的影响 大鼠脑组织经TTC染色后，正常组织呈深红色，而梗死区组织呈白色。假手术组大鼠脑组织切片未见梗死区域。与假手术组比较，模型组大鼠在缺血再灌注24 h后右侧大脑梗死体积显著增加(P<0.01)；与模型组比较，G-Rb3 14、28 mg/kg组大鼠脑梗死体积均明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

组别剂量(mg/kg)神经功能评分6h24h梗死体积(%)假手术组02)02)02)模型组1.97±0.652.24±0.7282.20±11.23G-Rb371.51±0.521)1.72±0.611)65.76±15.61141.49±0.631)1.66±0.561)50.25±20.771)281.42±0.541)1.51±0.582)30.06±16.082)

与模型组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.3 G-Rb3对大鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响 与假手术组比较，模型组血清MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px活性明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，G-Rb3 14、28 mg/kg组大鼠血清MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px活性均明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

2.4 G-Rb3对大鼠脑组织促炎症因子的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，G-Rb3 14、28 mg/kg组脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表3。

组别剂量(mg/kg)SOD(U/ml)GSH-Px(μmol/L)MDA(nmol/ml)假手术组309.28±36.132)102.42±17.481)12.10±3.422)模型组235.26±37.1270.54±12.6525.87±5.13G-Rb37260.18±42.5679.12±18.4019.26±5.6114295.37±31.611)91.53±13.061)14.15±4.482)28297.12±43.721)95.14±14.811)13.37±4.022)

组别剂量(mg/kg)IL-1β(ng/ml)TNF-α(ng/ml)IL-6(pg/ml)假手术组0.10±0.012)1.50±0.152)1.31±0.202)模型组0.28±0.022.59±0.312.24±0.25G-Rb370.23±0.032.13±0.301.92±0.36140.19±0.021)1.70±0.121)1.65±0.261)280.14±0.022)1.57±0.142)1.63±0.291)

3 讨 论

线栓法制备MCAO动物模型具有不用开颅、效果肯定、可以准确地控制缺血及再灌注时间，对动物本身的生理功能影响小、动物术后生存率高等特点。本实验采用MCAO线栓法成功建立了大鼠脑缺血2 h、再灌注24 h的损伤模型。神经功能评分是评价治疗脑缺血药物疗效的一项指标，可从运动功能的角度评价脑缺血再灌注损伤程度〔14〕。TTC染色法常用于评估组织的梗死面积。本研究中梗死体积百分比以梗死区体积与梗死区所在右侧半脑体积的比值表示，梗死体积以缺血总面积乘以脑切片厚度表示，梗死区所在右侧半脑体积以右侧半脑总面积乘以切片厚度表示，这就减小了因脑水肿、脑大小及脑缺血范围的不同对评估结果的影响〔15〕。本实验结果显示，G-Rb3能明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损伤和脑缺血。

氧化应激是指机体中活性氧(ROS)产生过多或者清除能力下降，氧化系统和抗氧化系统的平衡一旦受到破坏，会导致机体发生潜在的病理性损伤〔16〕。研究发现〔17,18〕，脑缺血再灌注损伤时，机体可产生大量ROS，这些ROS不能被内源性的抗氧化系统及时清除，导致DNA氧化，引起膜脂质过氧化反应等一系列的连锁反应。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，可以改变细胞膜的渗透性和流动性，是研究抗氧化能力的常用指标之一；SOD和GSH-Px都被称为自由基的清除剂，是对抗ROS过多产生的两种主要酶，二者活力的高低，能够间接反应机体清除氧自由基的能力〔19,20〕。实验结果表明，G-Rb3能明显升高MCAO大鼠血清中SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，提示其对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制可能是通过抑制氧自由基的过多产生，减弱机体的氧化损伤程度，增加机体的抗氧化应激能力实现的。

促炎性细胞因子是中枢神经系统疾病中的重要炎性介质。脑缺血可刺激内皮细胞和白细胞中黏附分子的表达，产生大量的促炎性细胞因子，从而导致白细胞的黏附以及向大脑软组织外渗〔21〕。实验结果表明，G-Rb3能抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后促炎症细胞因子的产生，提示G-Rb3对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其抗炎作用有关。

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〔2016-02-10修回〕

(编辑 徐 杰)

吉林省科技发展计划项目(20085060)

1 吉林大学药学院药理教研室

睢大筼(1957-)，男，教授，博士生导师，主要从事心脑血管药理学研究。

曲 莉(1963-)，女，主任医师，主要从事老年病、慢性疾病防控研究。

R791

A

1005-9202(2016)23-5791-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.009