荧光法测定窖泥中有效磷的研究

袁志强，汤有宏，刘国英，曹润洁，王志强，胡心行

(1.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州236820； 2.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽亳州236820)

荧光法测定窖泥中有效磷的研究

袁志强1，2，汤有宏1，2，刘国英1，2，曹润洁1，王志强1，胡心行1

(1.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州236820； 2.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽亳州236820)

对窖泥有效磷的测定方法——荧光分光光度法作了详细阐述，并探讨了窖泥中的有效磷对其质量的重要性。该法可提高窖泥磷检测的范围和准确度。标准曲线R2为0.9989，RSD值为3.81%，加标回收率在93.1%～108.4%之间。该方法适合对窖泥有效磷的检测。

窖泥； 检测； 有效磷； 荧光分光光度法

浓香型大曲酒生产所用的窖泥中含有丰富的菌系和酶系，其生化活动需要氮源、碳源、无机盐等养分，有效磷即为其中重要的一种，是构成细胞核膜的成分，也是能量物质ATP的来源。有效磷是指酸溶性磷和吸附态磷，能为菌类吸收利用。

传统的测磷法是磷钼蓝法，但有试剂易氧化、测定范围窄、精确度低等缺点。因此，本法利用荧光分光光度计进行测定窖泥研究，实测结果证明效果良好。在十二烷基苯磺酸钠存在下，吖啶橙作为能量给予体将自身能量转移给接受体罗丹明6G，使其荧光强度大幅提高。而磷钼酸与罗丹明6G形成离子缔合物使其荧光猝灭。按实验方法加入不同浓度的系列磷溶液，测得相对荧光强度差△F，绘制标准曲线。磷的浓度在一定范围内服从比尔朗伯定律[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

窖泥：取自本公司酿酒生产车间。

试剂及耗材：吖啶橙、罗丹明6G、钼酸铵、盐酸、氟化铵、磷酸二氢钾、十二烷基苯磺酸钠等试剂均为分析纯。

仪器设备：荧光分光光度计、分析天平、烘箱。

1.2 实验方法

1.2.1 有效磷测定方法

采用能量转移荧光法。

1.2.2 窖泥中有效磷的提取

取风干过筛的泥样1.0 g（做平行），置于50m L比色管中，加氟化铵-盐酸浸提液25m L，振摇使试样均匀分散，30m in内摇3次，充分振荡，用定量滤纸过滤，弃去初滤液1.5m L。再吸取滤液1.0m L，加水定容至50m L，摇匀再取1.0m L，加水定容至50m L，摇匀，如此重复，再取1.0m L，待测。

1.2.3 绘制工作标准曲线

(1)配制系列浓度的磷标准溶液。从干燥皿中取出烘干的KH2PO4，准确称取0.2195 g，溶于少量水中，定容到1000m L，取2.0m L，加水定容到500m L。分别取5m L、10m L、15m L、20m L、25m L，加水定容至50m L，为磷系列标准溶液。

(2)取5支10m L带塞比色管，按顺序尽快分别加入10-5mol/L吖啶橙1.0m L，5×10-6mol/L罗丹明6G 1.0m L，2.5×10-4mol/L钼酸铵1.0m L，1.2mol/L盐酸0.2m L，磷系列溶液1.0m L，0.01mol/L十二烷基苯磺酸钠0.5m L，加水至10.0m L，摇匀。同时另取1支10m L比色管，不加磷溶液，用蒸馏水代替，其他试剂同上,加水至10.0m L，摇匀，作为空白对照。

(3)各管摇匀后室温静置35m in。

(4)用荧光分光光度计扫描试样，在得到的激发/发射波长下测定荧光强度。

(5)以与空白比较的相对荧光强度差△F为横坐标，磷浓度为纵坐标，绘制出标准曲线。

1.2.4 窖泥有效磷的测定

(1)于10m L比色管中，依次加入配制好的吖啶橙1.0m L，罗丹明6G 1.0m L,钼酸铵1.0m L，盐酸0.2m L，1.2.2中待测的磷试样溶液1.0m L，十二烷基苯磺酸钠0.5m L，加水至10.0m L，摇匀。

(2)摇匀后,室温下放置35m in。

(3)于上述激发波长和发射波长测定其荧光强度，10min内测试完毕。

(4)于工作曲线上查得相应的磷含量，记为C（μg/L）。根据样品稀释倍数计算出有效磷含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按材料方法中所述检测步骤，先扫描得出激发/发射波长，测定荧光强度F，计算△F，绘制磷标准曲线，如图1所示。磷浓度在很窄的范围内(10.0～100.0μg/L)线性关系良好。在此浓度区间外其荧光强度呈现平稳变化趋势。通过扫描,可知激发波长为534.02 nm，发射波长558.97 nm。

图1 磷工作标准曲线

2.2 方法精密度和回收率实验

对3个窖泥样品分别进行6次重复性测试,以验证其精密度,结果见表1。

对同一窖泥样品进行不同水平的加标，每个添加水平做3次平行，最后计算平均回收率，结果见表2。

2.3 窖泥中有效磷的检测结果

从酿酒生产的各车间窖池中代表性地取窖泥样品，风干碾碎过40目筛，按上述的检测步骤分别测定其有效磷。结果见表3。

2.4 分析

通过实验发现，连续使用的池底中有效磷含量最高，而且其所含己酸菌和其他功能菌都比较活跃，养分需求比较高，窖池中积累了各种丰富的养分，如磷、腐殖质、氨氮、无机盐等，磷含量高的窖泥,其脱氢酶活性和其他指标也较高。新窖泥磷的含量相对较少，其中功能菌较少，综合活性较差；只有通过不断转排生产才能慢慢提高指标和活性。

表1 不同窖泥样品精密度实验

表2 方法回收率测定

表3 不同窖泥样品有效磷的测定结果

该法可以和检测窖泥的脱氢酶活性结合起来，其最大的优点在于可以反映出窖泥综合活性和产香能力。

有些窖泥样磷含量较低，试样制备时可少稀释10倍或20倍，以检测的荧光强度在工作曲线的线性范围内为准。

3 结论

浓香型白酒生产所用窖泥的质量与其所含的多种菌类及各种养分的多少密切相关。本方法测定窖泥中的有效磷具有准确度高、重复性好的特点，可运用于窖泥培养和酿酒生产中鉴定窖泥的质量，为指导酿酒生产提供科学指标和可靠依据。

[1] 刘保生,王桂华,孙汉文,等.吖啶橙-罗丹明6G能量转移荧光法测定痕量磷[J].分析化学,2001(1)：42-44.

[2] 袁志强,高江婧,唐林,等.窖泥脱氢酶活性测定方法的研究[J].酿酒科技,2012(4)：109-111.

[3] 胡承,应鸿,许德富,等.窖泥微生物群落的研究及其应用[J].酿酒科技,2005(3)：34-38.

[4] 沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社, 1998：644-645.

Determ ination of Effective Phosphorous in PitM ud by Fluorescence Spectrophotometry

YUAN Zhiqiang1,2,TANGYouhong1,2,LIU Guoying1,2,CAO Runjie1,WANG Zhiqiang1and HU Xinxing1
(1.AnhuiGujing Gongjiu Distillery Co.Ltd.,Bozhou,Anhui236820;2.AnhuiEngineering Technology Research Center for Solid-state Fermentation,Bozhou,Anhui236820,China)

In this paper,themethod of detecting of effective phosphorous in pitmud by fluorescence spectrophotometry was introduced.The importance of effective phosphorous to the quality of pitmud was investigated.Suchmethod could improve the detection range and the detection accuracy of phosphorous in pitmud.The correlation coefficient R2was 0.9989,RSD was 3.81%,and the recovery rate was between 93.1%to 108.4%.

pitmud;detection;effectivephosphorous;fluorescence spectrophotometry

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286(2016)12-0107-02

10.13746/j.njkj.2016247

2016-08-08

袁志强（1971-），男，工程师，从事酿酒技术研究工作，发表论文多篇；汤有宏（1967-），男，硕士，高级工程师。

优先数字出版时间：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.0931.003.htm l。