响应面法优化α-淀粉酶酶解木薯淀粉的工艺及动力学模型研究

高义霞 路宛如 杨金龙 周向军

(天水师范学院生命科学与化学学院，天水 741001)

响应面法优化α-淀粉酶酶解木薯淀粉的工艺及动力学模型研究

高义霞 路宛如 杨金龙 周向军

(天水师范学院生命科学与化学学院，天水 741001)

以葡萄糖值(DE)为考察指标，在单因素试验基础之上，利用响应面法研究时间、温度及酶与底物比(E/S)对α-淀粉酶酶解木薯淀粉的影响。利用Lineweaver-Burk和Wilkinson统计法求解米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)，并建立相应动力学模型。结果表明：α-淀粉酶酶解木薯淀粉制备葡萄糖的最佳参数为：温度60 ℃，E/S=0.1 U/mg、时间130 min。在此条件下，DE验证值为(82.91±1.32)%。在pH 6.0，50 ℃条件下，Km=12.077 mg/mL，Vm=0.218 mg/(mL·min)。在37～52 ℃范围内，Ea=44.611 kJ/mol，ΔH=110.847 kJ/mol。

木薯 酶解 动力学 响应面

木薯(Manihot utilissima)是全球三大薯类作物之一，广泛分布在我国海南、广西和广东等地区。木薯淀粉具有资源丰富、黏度高、糊化温度低，成膜性好等特点，在淀粉加工行业具有较大优势[1]。生物能源具有可再生性、环保性等特点，当今资源和能源日益紧张，无论是利用非粮糖质原料发酵生产燃料乙醇，还是利用油料作物、微藻等生产具有更突出优势的生物柴油[2]，均具有巨大的吸引力，将成为国家可持续发展战略的必然要求。目前，微藻异氧培养已被用于制备生物柴油，但葡萄糖占整个成本的80%[3]，致使培养基成本太高，但有关响应面法优化木薯淀粉酶解工艺及动力学研究鲜见报道。淀粉的酶解与其种类和浓度、pH、温度、酶的类型及离子强度等均有关，常规的米氏方程难以真实描述反应过程[4]，因此，在实际生产中，需进一步探讨酶促反应条件，以最大化发挥酶的催化作用[5-6]。

随生淀粉酶等新型淀粉酶的出现，直接选择淀粉颗粒作为底物进行水解成为一种趋势，本试验以温度、E/S及时间为因素，通过响应面法优化α-淀粉酶酶解木薯淀粉制糖的最佳工艺，同时对酶解动力学模型进行了研究，为降低微藻生产生物柴油成本提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木薯淀粉，质量分数为(86.167±1.137)%：山东枣庄三亩粮田；α-淀粉酶(58.7 U/mg)： Sigma公司(Lot：STBB0510，来自枯草芽孢杆菌)；苯酚：天津市红岩化学试剂厂；葡萄糖：天津登丰化学品有限公司。

1.2 主要仪器

TGL-20M型高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；722型可见分光光度计：上海欣茂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作及木薯淀粉的酶解

参考3，5-二硝基水杨酸(DNS)法[7]。0.4 mg/mL葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，加蒸馏水至2 mL，混匀，加入1.5 mL DNS，沸水浴加热5 min，冷却后补至3.5 mL。540 nm测定吸光值。Y=2.425 4X-0.090 1，r=0.992(X为葡萄糖质量/mg，Y为OD)。称取木薯淀粉0.1 g，加入20 mL 0.05mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液，搅拌10 min，80 ℃糊化5 min，冷却，按E/S=0.02 U/mg加入α-淀粉酶液，振荡混匀，45 min后迅速沸水灭活5min，5 000 r/min离心10 min，测定吸光值，计算葡萄糖值(DE)。

DE/%=还原糖量(mg)×100/淀粉(mg)

(1)

式中：v为反应速率/mg/mL·min，m/V为还原糖含量/mg/mL；t为反应时间/min。

1.3.2 单因素试验

按1.3.1，考察温度(30、40、50、60、70 ℃)、E/S(0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 U/mg)、时间(10、20、40、60、80、100、120、150、180 min)及pH(4、5、6、7、8)对DE的影响。

1.3.3 酶促反应动力学模型

Michaelis和Menten根据快速平衡学说建立米氏方程，Briggs和Haldane用稳态代替快速平衡态，对米氏方程做了修正，得到更合理的酶促反应动力学过程。推导过程[8]：

(2)

(3)

(4)

vm=k3E总

(5)

(6)

式中:k1为ES生成速率；k2、k3分别为ES分解为E+S和P+E的速率；k4为E+P生成ES的速率(反应初期忽略不计)；[S]为底物质量浓度/mg/mL；E总(U/mL)=[E]+[ES]。将式(6)线性化处理，得Lineweaver-Burk方程：

(7)

求Km和Vm；利用Wilkinson统计法求Km和Vm。

1.3.4 响应面法优化酶解工艺

参考李忠海等[9]的方法，固定pH为6.0，以温度、E/S、时间为因子，各因子最优点为基准点，确定适度步长，DE为响应值，利用Design-Expert 8.06设计试验，见表1。

表1 Box-Benhnken试验因素水平及编码

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素试验

时间对DE的影响见图1a，在该条件下，在0～120 min范围内，DE随时间的增加而增大，随后趋于平缓，甚至出现下降，这是因为在酶解过程中，不仅发生淀粉的水解反应，同时还存在较弱的复合反应[10]。DE在28%以下，复合糖几乎不能生成，但随着DE的进一步增加，复合糖生成速率逐渐超过淀粉水解速率，因此，DE将不断减少。温度对DE的影响见图1b(P<0.05)，温度为50 ℃时，DE达到最大，表明最适温度为50 ℃。一方面，温度升高，分子间碰撞次数增加，反应速率增加；另一方面，作为蛋白质，酶随温度逐渐升高而逐渐变性失活，导致反应速率下降，因此温度在50～60 ℃范围内选择。E/S对DE的影响见图1c(P<0.05)，反应初期，随E/S的增大，酶解速率几乎呈线性增大，这是因为，在底物过量的情况下，酶促反应速率与酶量成正比；随反应的进行，虽然E/S进一步增大，但由于底物出现不足，反应速率的增大程度将会变得缓慢，甚至出现下降趋势[11]。E/S选择0.08 U/mg。pH对DE的影响见图1d(P<0.05)，pH 6.0时，DE达到最大值，表明酶的最适pH为6.0。pH可影响酶分子活性中心上必需基团的离子化程度，也可影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合[12]。

图1 单因素试验

2.2 响应面分析

Y=58.46-0.008 75X1+5.2X2+3.4X3+2.39X1X2+3.02X1X3+1.89X2X3+2.7X12-2.1X22+8.56X32

E/S和时间的P<0.000 1，表明其对DE影响极显著；温度的P>0.05，影响不显著。各因素影响大小依次为E/S、时间及温度。二次项X12、X22、X32影响极显著，交互项的影响大小依次为X1X3、X1X2、X2X3，均达到极显著水平，表明响应值Y的变化相当复杂，各因素对DE的影响并非简单的线性关系，而是呈二次关系，且3个因素间存在交互作用。去掉不显著因素则有：

Y=58.46+5.2X2+3.4X3+2.39X1X2+3.02X1X3+1.89X2X3+2.7X12-2.1X22+8.56X32

最优工艺：温度60 ℃，E/S0.1 U/mg和时间130 min，预测DE为83.53%。验证结果见表4。

表2 Box-Benhnken试验设计表及结果

表3 回归模型系数显著性检验及其方差分析

表4 回归模型的6组参数及其验证结果

验证试验平均值(82.91±1.32)%，n=6，RSD=1.59%，表明模型有效，可用于木薯淀粉酶解参数的优化。

2.3 Lineweaver-Buck法求解参数

V-S曲线及1/V-1/S作图见图2a和图2b，Y=74.8X+3.722，r=0.991，方程极显著。计算得Vm=0.269 mg/(mL·min)，Km=20.097 mg/mL。

图2 底物浓度与反应速率的关系

2.4 Wilkinson统计法求解参数

2.4.1 最小二乘法求估算解

Wilkinson统计法求估算解见表5。表5可知，Δ=αε-γδ=0.000 000 000 007 585 3。Vm0=(βε-δ2)/Δ=0.122 mg/(mL·min)，Km0=(βγ-αδ)/Δ=7.323 mg/mL。

式中：Vm0和Km0分别为最大反应速度和米氏常数估算值。

2.4.2 泰勒展开式求精校解

(8)

表6，Δ′=α′β′-γ′2=0.000 000 004 190 58，b1=(β′δ′-γ′ε′)/Δ′=1.785，b2=(α′ε′-γ′δ′)/Δ′=8.485。求得精确解为Vm=Vm0b1=0.218 mg/(mL·min)；Km=Km0+b2/b1=12.077 mg/mL；式中：b1和b2分别为Vm和Km计算过程中修正常数。

表5 Wilkinson统计法求估算解

表6 Wilkinson法精校解

2.4.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法的比较

表7 Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法数据比较

2.5 Ea及ΔH计算

在37～52 ℃范围内，反应速率随温度的增加而增大，以lnv对1/T(×103)作图，见图3，呈直线关系，用阿累尼乌斯(Arrhenius)方程拟合：

图3 lnv-1/T

图4 lnKs-1/T

(9)

式中：R为气体常数8.31{J/(molK)}；Ea为活化能(kJmol)；B为积分常数。将式(9)写成指数形式，K3=A×exp(-Ea/RT)，A为指前因子{mg/(mL·min)}，Y=10.079 48-5.368 31X，r=0.994。求得Ea= 44.611 kJ/moL，A=23 848.581 mg/(mL·min)，r=0.994，表明Arrhenius方程对该数据的拟合是极显著的。平衡常数Ks与温度T服从范特柯夫方程：lnKs=-ΔH/RT+lnC(10)，K3≥K2，Ks≈Km，以不同温度下Km与1/T回归[16]，见图4，Y=44.053-13.339X，r=0.983，ΔH=110.847 kJ/mol。

3 结论

利用响应面法优化α-淀粉酶酶解木薯淀粉，对酶解动力学进行研究。结果表明：酶解模型为：Y=58.46+5.2X2+3.4X3+2.39X1X2+3.02X1X3+1.89X2X3+2.7X12-2.1X22+8.56X32。酶解工艺为：温度60 ℃，E/S=0.1 U/mg和时间130 min，在此条件下，DE验证值为(82.91±1.32)%，RSD=1.59%。在pH 6.0，50 ℃条件下，Km=12.077 mg/mL，Vm=0.218 mg/(mL·min)。在37～52 ℃范围内，Ea=44.611 kJ/moL，ΔH=110.847 kJ/mol。

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Enzymolysis Technology of Cassava Starch Using Response Surface Method and Its Kinetics Modeling

Gao Yixia Lu Wanru Yang Jinlong Zhou Xiangjun

(Life Science and Chemistry Department, Tianshui Normal Colleage, Tianshui 741001)

Dextrose equivalent value (DE) has been utilized as an index; the effects of time, temperature and the ratio of enzyme to substrate concentration (E/S) on enzymolysis of cassava starch with α-amylase have been explored based on Single Experiment and Response Surface Method. The michaelis constant (Km), maximum velocity (Vm) and its corresponding kinetics modeling were also researched. The results indicated that the optimal parameters were as follows: temperature of 60 ℃,E/S=0.1 U/mg and time of 130 min. The verification DE could reach (82.91±1.32)%. On condition of pH 6.0 and temperature at 50 ℃,Km,Vm could be 12.077 mg/mL and 0.218 mg/(mL·min) respectively.Ea and ΔHwere 44.611 and 110.847 kJ/mol in the temperature range of 37 to 52 ℃ respectively.

cassava starch, enzymolysis, kinetics, response surface method

TS201.1

A

1003-0174(2016)02-0013-05

天水师范学院“青蓝”人才工程(75201406)

2014-07-01

高义霞，女，1982年出生，硕士，食品化学

周向军，男，1980年出生，讲师，食品酶学