电针对脑出血大鼠海马区Nogo—A表达的影响

王风波+唐明薇+董海

[摘要] 目的 探讨电针对脑出血大鼠出血同侧海马区Nogo-A表达的影响及作用机制。 方法 将66只成年SD大鼠按随机数字表法分为对照组和脑出血组，脑出血组再随机分为非干预组和电针组，Ⅶ型胶原酶脑内注射诱导大鼠尾状核出血，电针组于造模次日开始电针干预，各组大鼠于第2、5、10、15天取出血侧海马C1区脑组织石蜡切片行Nogo-A免疫组化检测，每例脑组织取3张切片，每张切片于400倍光镜下随机选取5个互不叠加视野计数阳性细胞并取其平均值。 结果 脑出血组大鼠右侧尾状核区域有血肿形成；与对照组比较，非干预组与电针组海马区Nogo-A阳性表达水平均显著增强（P < 0.01），而电针组较非干预组表达水平明显下降（P < 0.01）。 结论 电针干预可显著抑制脑出血大鼠脑内Nogo-A的表达，有利于脑出血后中枢神经轴突的再生修复，促进神经功能恢复。

[关键词] 电针；海马区；脑出血；Nogo-A

[中图分类号] R245.97 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanism of electro-axupuncture on the expression of Nogo-A in hippocampus at the same side of bleeding in rats with cerebral hemorrhage. Methods Sixty-six adult SD rats were randomly divided into control group and cerebral hemorrhage group by the random number table， and the cerebral hemorrhage group was randomly divided into non-intervention group and electro-axupuncture group. Hemorrhage of caudate nucleus in rats was induced by intracerebral injection of collagenase Ⅶ， the electro-axupuncture group was given electro-axupuncture intervention in the next day of molding， the rats of all groups were taken paraffin section of brain tissues in C1 area of hippocampus of bleeding side at the second， fifth， tenth， fifteenth day， each case of brain tissue was taken 3 slices， 5 non-overlapping field of views were randomly selected from each slice under 400 times light microscope to count the positive cells and take the average value. Results The cerebral hemorrhage group had hematoma at the right caudate nucleus. Compared with the control group， the positive expression levels of Nogo-A in hippocampus of non-intervention group and electro-axupuncture group were significantly enhanced （P < 0.01）， while the expression level of electro-axupuncture group was significantly lower than that of non-intervention group （P < 0.01）. Conclusion Electro-axupuncture can significantly inhibit the expression of Nogo-A in rats with cerebral hemorrhage， which is helpful for the regeneration and repair of nervous centralis axon after cerebral hemorrhage and to promote the recovery of neurological function.

[Key words] Electro-axupuncture； Hippocampus； Cerebral hemorrhage； Nogo-A

脑出血是危害性最大的脑卒中类型，严重危害患者身心健康，虽然随着现代医疗水平的不断进步，脑出血的病死率明显降低，但其所致的神经行为学功能障碍往往康复周期长，治疗效果慢，严重影响患者生活质量及重返社会。脑卒中后中枢神经轴突的修复与再生机制十分复杂，受到神经生长促进因素与轴突生长抑制因素的双重调节[1]。Nogo-A来源于神经髓鞘细胞，是已知的一种对神经轴突再生抑制作用最强烈的网状蛋白，有研究发现Nogo-A在大脑皮层发育、神经元迁移与分化、神经生长锥活性调节与突触稳定性等方面均发挥着重要作用[2]。电针作为历史悠久的传统与现代医学相结合的康复治疗手段，已被临床广泛证实可促进脑卒中患者的神经功能恢复，改善记忆及学习能力，但其作用机制目前仍不十分清晰[3]。本研究旨在通过观察电针干预对脑出血大鼠出血同侧海马区Nogo-A的表达影响，进一步探讨电针干预在脑出血后中枢神经轴突修复与再生过程中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

66只SD成年大鼠（11～12月龄），均雄性，体重200～250 g [成都医学院动物实验中心，合格证号SYXK（川）2015-196]；胶原Ⅶ型（Sigma）；兔抗大鼠Nogo-A抗体及SABC试剂盒（武汉博士德）；大鼠脑立体定位仪（江湾Ⅰ）；动物颅骨钻（ALC-CED）。

1.2 方法

66只SD大鼠以1～66数字标识，随机分为脑出血组（n = 42）、对照组（n = 24），脑出血组又随机分为非干预组（n = 24）和电针组（n = 18）。参照王风波等[1]及杨洁等[4]的方法制备胶原酶脑内注射诱导尾状核脑出血模型：注射点定位矢状线右侧3 mm、前囟后0.5 mm，胶原酶与生理盐水配制为0.6 U/1.5 μL溶液，全程无菌操作，对照组假手术方法同脑出血组，以同等剂量生理盐水代替胶原酶。所有大鼠均常规饲养，保持室内温度24℃左右，干静阴凉，通风，相对湿度50%左右。术后第2天（24 h）随机处死对照组和非干预组大鼠各6只并取脑，观察脑出血情况，以SABC免疫组化法检测出血同侧海马C1区Nogo-A表达。大鼠右侧尾状核区域有直径约3 mm的血肿形成为脑出血造模成功。电针组大鼠造模次日开始电针干预，1次/d，共15 d。对照组及非干预组大鼠常规饲养，不予任何干预。各组大鼠分别于第5、10、15天行免疫组化Nogo-A检测。

1.3 电针干预

电针组大鼠取穴百会、大椎、曲池及足三里，具体操作参照《实验针灸学》及王风波等[1]的方法，各穴均连接电针仪，频率5～10 Hz，以致大鼠头部轻微抖动为度，10 min/次。

1.4 出血侧海马区Nogo-A免疫组织化学检测

免疫组化检测采用SABC法，阴性对照PBS代替一抗。光镜下Nogo-A阳性细胞显示为神经元胞浆内有棕黄色或棕褐色免疫颗粒。每例脑组织取3张切片，400倍光镜下随机选取5个互不叠加的视野，计数阳性细胞并取其平均值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较用q检验，非正态分布及方差不齐用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肉眼及光镜下大鼠出血侧脑组织病理改变

以进针点冠状面切开脑组织，可见脑出血组大鼠右侧尾状核区域有直径约3 mm的血肿形成，光镜下见血肿区大量红细胞渗出，神经元变性坏死，血肿边缘有小胶质细胞与中性粒细胞浸润。对照组大鼠相应区域无血肿形成。

2.2 大鼠出血侧海马区Nogo-A免疫组化检测情况

对照组右侧海马C1区散在分布少量Nogo-A阳性细胞，非干预组、电针组右侧海马C1区Nogo-A阳性细胞数量明显增多，胞核固缩且形态多样。与对照组比较，非干预组、电针组Nogo-A阳性反应在各时间点均明显增强，阳性细胞计数显著上升（P < 0.01）；而电针组大鼠Nogo-A阳性表达水平较非干预组有明显降低，两组不同时间点比较差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1（封三）、表1。

3 讨论

脑出血作为危害性最大的脑卒中类型，约占脑血管意外疾病的20%，目前循证医学证实脑出血的有效治疗手段依然较少[5]，虽然医疗设备和技术均不断进步，但脑出血患者致残率并未有明显的下降，早期的积极康复介入不仅能够有效促进患者运动、感觉、认知、语言等功能恢复，还能预防并发症，提高生活质量，甚至重返社会[6]。中枢神经轴突损伤的修复与再生受到神经生长因子促进因素与神经轴突生长抑制因素的双重调节，有效抑制轴突生长抑制因素的表达水平，对脑卒中后神经轴突修复无疑具有重要的意义[1]。Nogo-A是目前已知的抑制作用最强烈的神经轴突再生抑制因子，本身是一种网状蛋白，由Nogo基因表达，与特定受体NgR结合可诱导神经生长锥溃缩、塌陷，在神经元的迁移与分化、调节神经生长锥活性与突触稳定性等方面都扮演着重要角色[2]。有研究显示Nogo-A只表达于生长锥中心微管区，在生长锥周围区域几乎未见阳性信号，提示Nogo-A可能主要富集于胞体、突起及生长锥的微管区，通过调控微管活性及乙酰化水平影响轴突生长[7]。赵修等[8]在弥漫性轴索损伤大鼠的大脑皮层、白质、海马、胼胝体及脑干5个脑区观测Nogo-A的表达变化，发现前述几个区域的神经元及少突胶质细胞中均可见明显的Nogo-A表达，其中以神经元表达为著，少突胶质细胞及其髓鞘相对较少，印证了Nogo-A对其他神经元、轴突和非神经细胞具有排斥、吸引的双重功能，在神经元-神经元、神经元-胶质细胞之间的交互作用中很可能起到重要作用。张敏等[9]根据间歇低氧循环交替法制备5%间歇低氧组和10%间歇低氧大鼠模型，病理学检测显示间歇低氧组大鼠大脑齿状回神经细胞有死亡现象，神经元密度下降，死亡神经细胞的胞核皱缩浓染，细胞周围间隙变宽，尤以5%间歇低氧组更为明显，免疫组织化学检测到间歇低氧组大鼠齿状回区脑细胞胞质及轴突突起近侧端内Nogo-A表达显著升高，且随着脑缺氧的时间增加，Nogo-A的表达水平呈逐渐增高趋势，与病理学表现相对应，5%间歇低氧组Nogo-A阳性表达水平最高，提示间歇低氧程度越重神经元受损越严重，Nogo-A阳性反应越显著。慢性间歇性缺氧的反复缺氧复氧循环方式所致的病理生理改变类似于中枢神经系统缺血再灌注过程，大量活性氧自由基的产生引起了氧化应激反应，极易引起中枢神经损伤和细胞凋亡。部分海马齿状回下区的新生细胞可迁移到颗粒细胞层分化生成新的树突及轴突，重新形成突触联系并整合到海马的神经环路功能，但在脑的慢性间歇缺氧过程中，Nogo-A通过轴突生长抑制区域Nogo-66与特异性受体NgR相结合，发挥出轴突生长抑制作用并导致神经细胞生长锥回缩，阻碍轴突生长修复，间接阻断了受损神经纤维的再生及发育[10]，可能慢性间歇缺氧性脑损伤在一定程度或时间窗可启动中枢神经系统损伤修复机制，但这种修复信息可刺激产生负反馈作用并上调神经生长抑制因子受体NgR表达水平，提供更多的Nogo-A结合位点，使Nogo-A得以发挥出更高的轴突生长抑制水平。

不仅限于大脑组织内，有学者还发现大鼠脊髓损伤后少突胶质细胞和髓磷脂将细胞内的Nogo-A释放出到细胞外基质，在脊髓损伤区呈先抑后扬式表达，在损伤后第7天达高峰，14 d逐渐回落，但仍然高于假手术组水平，提示脊髓损伤后Nogo-A的高水平表达可能是阻碍神经系统恢复与再生的重要因素之一[11]。丁永利等[12]用Nogo-A抗体经蛛网膜下腔灌注脊髓全横断大鼠，每日1次，共10次，发现大鼠脊髓横断损伤区近侧端有较多的再生神经纤维，而损伤区的再生神经纤维很少，损伤区远侧几乎无神经纤维再生，说明抑制Nogo-A的阳性表达可降低神经轴突生长的抑制因素，间接促进中枢神经轴突再生，尤其是长纤维传导束的轴突再生能力。

电针作为集针刺与电刺激优点于一体的治疗手段，应用于脑卒中已有较丰富和肯定的基础研究成果。梁艳桂等[13]电针取缺血再灌注损伤大鼠神庭、百会穴，观察到电针组大鼠脑梗死区面积明显减小，提示电针神庭、百会穴可降低脑梗死大鼠的梗死面积，促进脑损伤修复。褚鑫等[14]电针自体血注入法脑出血大鼠百会、人中穴，Berderson行为学评分显示脑出血组较对照组显著升高，电针组大鼠出血灶周围脑组织水肿减轻，炎症细胞减少，细胞排列规整，其中6 h电针组改善最为明显，提示早期电针干预对脑出血后脑组织修复具有积极的作用。有关电针在脑损伤后Nogo-A表达变化的基础研究等方面，陈成等[15]电针局灶性脑缺血大鼠天泉、曲泽、内关、大陵诸穴，分别检测脑梗死区和血清神经生长因子（NGF）与Nogo-A含量，实验结果显示电针可促进大鼠脑梗死区和血清中NGF的表达并降低血清Nogo-A的含量，二者作为神经修复矛盾的双方，在脑损伤后表达发生相反变化，说明电针既可改善大鼠脑缺血后突触超微结构，促进神经修复，又能够降低神经轴突抑制因子的表达，从而诱导神经轴突再生，减轻脑梗死后的神经损害，但需要指出的是，该电针组大鼠脑内Nogo-A的表达量组间差异不显著，提示在脑缺血急性期脑内Nogo-A的表达可能不稳定。陈吉祥等[16]电针脑缺血再灌注大鼠百会、神庭穴，7 d后电针组梗死侧海马区Nogo-A及其受体NgR的表达均显著下降，同时利用Morris水迷宫实验发现，电针组大鼠逃避潜伏期和找到平台所经过的路程较模型组明显缩短，跨越平台次数明显增加，证明电针在抑制脑缺血大鼠Nogo-A表达与改善学习记忆能力之间呈正相关。研究成果已经证实，针刺脑卒中大鼠百会、曲池、足三里穴可以减轻脑损伤反应，促进损伤恢复，电针功效优于单纯针刺作用。各种脑卒中后脑区Nogo-A表达均有不同程度升高，不利于神经再生与修复，而早期电针干预有助于抑制Nogo-A的阳性反应。

目前有关电针干预脑卒中Nogo-A表达变化的基础研究主要集中于脑梗死及脊髓损伤方面，尚未见到电针对脑出血Nogo-A表达变化影响的相关研究报道。脑出血大鼠模型制备技术已经较为成熟，并且在笔者前期的研究中初步检测到脑出血后Nogo-A表达变化相关情况[1]，基于此，本研究制备Ⅶ型胶原酶诱导尾状核出血大鼠模型，造模成功次日即开始电针百会、曲池、足三里诸穴，观察出血后不同时间点出血侧海马区Nogo-A的表达情况，实验结果显示电针上述诸穴对脑出血后海马区Nogo-A的表达有显著的抑制作用，进一步说明了电针能够调节脑损伤后中枢神经负性调节作用，抑制神经生长锥的溃缩、塌陷，降低神经再生与修复的阻碍因素。本研究虽然仅从大鼠出血侧海马区Nogo-A表达的角度探讨电针对脑出血的康复治疗意义，但考虑到Nogo-A在神经重塑方面的重要负性调节作用，对临床上脑出血患者治疗过程中的电针取穴选择提供了一定的实验依据，但脑卒中的针灸治疗精微复杂，更多更佳的电针穴位选择尚有待于进一步研究。

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（收稿日期：2016-07-13 本文编辑：张瑜杰）