半乳糖凝集素1在脐带来源间充质干细胞调控类风湿关节炎患者T细胞功能中的作用

孙 琳，安 卓，李常虹，刘 蕊，赵金霞，刘湘源

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)



·论著·

半乳糖凝集素1在脐带来源间充质干细胞调控类风湿关节炎患者T细胞功能中的作用

孙 琳，安 卓，李常虹，刘 蕊，赵金霞，刘湘源△

(北京大学第三医院风湿免疫科， 北京 100191)

目的：明确半乳糖凝集素1(galectin-1)在脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)调控类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者T细胞功能中的作用。方法： 应用慢病毒构建galectin-1低表达的UC-MSCs，即UC-MSCs(Gal-1-)，采用直接接触培养方式分别将UC-MSCs、UC-MSCs(Gal-1-)与RA患者的CD4+T细胞共培养。设立阴性对照组(CD4+T)、阳性对照组[CD4+T培养过程中加入植物血凝素(phytohae-magg lutinin，PHA)2 mg/L]、UC-MSCs-CD4+T共培养组、UC-MSCs(对照shRNA)-CD4+T共培养组及UC-MSCs(Gal-1-)-CD4+T共培养组。MTS法检测CD4+T细胞增殖，ELISA方法检测共培养上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factors α, TNF-α)水平，流式细胞术检测Th1/Th2/Th17细胞亚型。结果： UC-MSCs和UC-MSCs(对照shRNA)与CD4+T细胞共培养组可显著抑制PHA诱导的CD4+T细胞增殖及TNF-α表达，而UC-MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用。与阴性对照组(8.51%±2.04%)相比，UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可显著抑制Th1细胞分化(分别为4.83%±1.37%和5.13%±0.87%，P值分别为0.012和0.018)，而UC-MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用(6.41%±0.96%，P=0.101)。与阴性对照组相比，UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可上调Th2并下调Th17比例，但差异并无统计学意义，UC-MSCs(Gal-1-)组的这一作用不明显。结论： UC-MSCs可抑制RA患者CD4+T细胞的增殖、活化并可降低Th1细胞比例，但敲低galectin-1分子的表达后该作用减弱，提示galectin-1参与了UC-MSCs抑制RA患者CD4+T细胞功能的过程。

关节炎，类风湿；间质干细胞；半乳糖凝集素类

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，可来源于骨髓、脂肪和脐带组织，该细胞具有非特异性的免疫抑制和抗增殖作用，对多种自身免疫性疾病有潜在的治疗作用[1-3]。在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)中，MSCs的治疗潜能越来越受到关注。研究证实脐带来源间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells UC-MSCs)能有效抑制RA患者的T细胞及成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast like synoviocyte, FLS)活化，UC-MSCs可减轻胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)小鼠的滑膜炎症和骨破坏[4]。国内应用UC-MSCs静脉输注治疗RA也取得了良好效果[5]，这提示UC-MSCs有可能成为RA的新疗法。T细胞活化是RA发病的中心环节，RA患者的滑膜及外周血中可见大量寡克隆增殖的T细胞，此外，患者还存在辅助性T细胞(helper T cell，Th)(Th1/Th2细胞)的分化异常，但目前关于UC-MSCs对RA患者CD4+T细胞的免疫调控机制尚不清楚，限制了此种新疗法的应用推广。

半乳糖凝集素1(galectin-1)属于galectins家族即β-半乳糖苷结合蛋白家族[6]。galectin-1被认为是免疫反应的负调节蛋白，可以抑制活化T细胞的增殖，促进其凋亡，抑制Th1型和Th17型细胞因子的分泌且促进Th2型细胞因子的分泌[7-8]。近年来有研究显示，galectin-1在骨髓间充质干细胞的免疫调节中发挥重要作用[9-11]。我们前期的研究也证实UC-MSCs高表达galectin-1[12]，因此推测galectin-1参与UC-MSCs调节RA患者CD4+T细胞功能的过程。本研究应用慢病毒shRNA感染UC-MSCs，敲低galectin-1分子的表达，以明确galectin-1在UC-MSCs调控RA患者CD4+T细胞功能中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象取材

新生儿脐带取自北京大学第三医院产科足月剖宫产的健康产妇，留取RA患者外周血，磁珠法分选CD4+T细胞。本研究获得北京大学第三医院医学伦理委员会批准(IRB00006761．2012011)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

FasGrow人间充质干细胞条件培养基购自北京百乐通生物技术有限公司，鼠抗人细胞表面标记抗体购自美国BD Biosciences公司，成骨、成脂分化诱导培养基购自广州赛业生物科技有限公司，慢病毒Ad/galectin-1 shRNA构建于上海吉凯基因化学技术有限公司，MTS试剂购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factors α, TNF-α)ELISA检测试剂盒购自Raybio公司，PerCP-Cy5-CD3、FITC-CD8、PE-IFN-γ、PE-IL-4及PE-IL-17流式抗体购自eBioscience公司。

1.3 UC-MSCs的分离培养与鉴定

取脐带放入高压灭菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，反复冲洗后小心撕取动、静脉周围的Wharton’s jelly组织，剪成小块接种于培养瓶中，培养7～10 d后显微镜下观察组织块周围呈集落生长的成纤维状细胞。取培养至P3代的UC-MSCs制成单细胞悬液，加入藻红蛋白(P-phycoerythrin, PE)或异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的单克隆抗体，流式细胞术检测细胞表面分子CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45及人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-DR的阳性率。将P3代UC-MSCs接种于6孔板中，将培养液改为成骨/成脂诱导分化培养液进行诱导，最终固定细胞后分别用茜素红和油红O对诱导后的细胞进行染色。

1.4 构建galectin-1低表达的UC-MSCs

构建Ad/galectin-1 shRNA及对照shRNA慢病毒，转染UC-MSCs，构建galectin-1低表达的UC-MSCs，即UC-MSCs(Gal-1-)。应用PCR和Western blot法检测galectin-1的表达水平，验证干扰表达的效果。

1.5 galectin-1对UC-MSCs调控RA患者CD4+T增殖及分泌TNF-α的影响

采用直接接触方式将UC-MSCs和CD4+T共培养，共培养前UC-MSCs均经钴60照射。设立阴性对照组(CD4+T)、阳性对照组[CD4+T培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagg lutinin，PHA)2 mg/L]、UC-MSCs-CD4+T共培养组、UC-MSCs(对照shRNA)-CD4+T共培养组及UC-MSCs(Gal-1-)-CD4+T共培养组。培养时间为48 h，每组细胞设3个复孔，实验终止时采用MTS法检测CD4+T细胞的增殖情况，另外，在相同条件下收集各组培养上清液，ELISA法检测TNF-α水平。

1.6 galectin-1对UC-MSCs调控RA患者Th细胞分化的影响

各组细胞培养72 h，加入佛波酯、离子霉素和莫能霉素，培养5 h，收集悬浮的CD4+T细胞，每组又分为对照管和实验管。实验管分别加入PerCP-Cy5-抗CD3、FITC-抗CD8 mAb，4 ℃避光放置30 min对细胞表面抗原进行染色，固定破膜后分别加入PE-抗IFN-γ/PE-抗IL-4/PE-抗IL-17 mAb，对照管加入同型对照抗体，4 ℃避光孵育30 min后采用流式细胞仪检测分析。

1.7 统计学分析

所有实验数据均采用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验结果均以均数±标准差表示，多组间计量资料采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC-MSCs的鉴定

流式细胞仪检测细胞表面分子标志，结果显示细胞高表达CD29(99.87%)、CD44(99.82%)、CD73(93.46%)、CD90(99.17%)和CD105(98.93%)，不表达CD14(0.12%)、CD34(0.48%)及CD45(0.22%)3种造血细胞表面标记和免疫排斥相关分子HLA-DR(0.19%)。UC-MSCs在成骨和成脂诱导分化培养基作用后，诱导成功的成骨细胞胞质内可见被茜素红染成桔红色钙结节，而诱导成功的脂肪细胞胞质内可见被油红O着色的脂滴。免疫表型分析及成骨、成脂诱导分化结果均符合国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞的鉴定标准[12]。

2.2 UC-MSCs(Gal-1-)细胞的建立及检测

galectin-1-shRNA慢病毒siRNA序列为GCTGCCAGATGGATACGAA，采用GV248慢病毒载体。UC-MSCs中加入不同含量的galectin-1-shRNA慢病毒，培养后在荧光显微镜下观察，结果显示MOI(multiplicity of infection)为50时，转染效率达到90%以上(图1)。嘌呤霉素筛选细胞后，用PCR及Western blot检测细胞中galectin-1的表达，结果显示转染galectin-1-shRNA慢病毒后UC-MSCs(Gal-1-)中galectin-1的表达明显下调(图2)。

A, light microscope; B, fluorescence microscopy. UC-MSCs, umbilical cord mesenchymal stem cells.

图1 Galectin-1-shRNA慢病毒转染UC-MSCs

Figure1 Galectin-1-shRNA lentivirus transfected to UC-MSCs

A, the mRNA level of galectin by RT-PCR; B, the protein level of galectin by Western blot. 1, UC-MSCs(Gal-1); 2, UC-MSCs (negative control shRNA); 3, UC-MSCs. UC-MSCs, umbilical cord mesenchymal stem cells.

图2 慢病毒转染后UC-MSCs中galectin-1的表达

Figure2 The expression of galectin-1 on lentivirus shRNA transfected UC-MSCs

2.3 galectin-1可影响UC-MSCs对RA-CD4+T增殖及分泌TNF-α的抑制作用

MTS结果显示，UC-MSCs-CD4+T共培养组可显著抑制PHA诱导的CD4+T细胞的增殖(图3)及TNF-α表达(图4)，UC-MSCs(对照shRNA)-CD4+T共培养组同样可以明显抑制PHA对CD4+T的增殖作用及TNF-α表达，而UC-MSCs(Gal-1-)组无明显抑制作用。

2.4 敲低galectin-1可影响UC-MSCs对RA患者Th亚型的调控作用

与对照组(8.51%±2.04%)相比，UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可显著抑制Th1细胞分化(4.83%±1.37%和5.13%±0.87%，P值分别为0.012和0.018)，而UC-MSCs(Gal-1-)组对其无明显抑制作用(6.41%±0.96%，P=0.101，图5)。

1, negative control; 2, PHA 2 mg/L; 3, PHA+UC-MSCs; 4, PHA+UC-MSCs(negative control shRNA); 5, PHA+UC-MSCs(Gal-1). * P<0.05, compared with the other groups; # P<0.05, compared with the PHA group; & P<0.05, compared with the UC-MSCs group. PHA, phytohaemagg lutinin; UC-MSCs, umbilical cord mesenchymal stem cells.

图3 Galectin-1表达影响UC-MSCs对CD4 T细胞增殖的抑制作用

Figure3 Galectin-1 affected the inhibition effect of UC-MSCs on CD4T cell

1, negtive control; 2, PHA 2 mg/L; 3, PHA+UC-MSCs; 4, PHA+UC-MSCs (negative control shRNA); 5, PHA+UC-MSCs(Gal-1). * P<0.05, compared with the other groups; # P<0.05, compared with the PHA group; & P<0.05, compared with the UC-MSCs group. Abbreviations as in Figure 3.

图4 Galectin-1对UC-MSCs调控CD4 T细胞分泌TNF-α的影响

Figure4 Galectin-1 affected the TNF-α level of CD4 T cell regulated by UC-MSCs

与阴性对照组相比，UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可上调Th2并下调Th17比例，但差异无统计学意义，UC-MSCs(Gal-1-)组的这一作用不明显，Th2分别为2.71%±1.15%、4.13%±0.74%、3.57%±0.76%、3.01%±0.34%，P值分别为0.060、0.221、0.644；Th17分别为1.67%±0.45%、0.89%±0.44%、0.83%±0.38%、1.41%±0.62%，P值分别为0.085、0.068、0.518。

3 讨论

RA是一种以慢性关节炎症和骨质破坏为主要特征的全身自身免疫性疾病，如果不经过正规治疗，可发生关节畸形，严重影响患者的生活质量。目前RA治疗多采用甲氨蝶呤、来氟米特等慢作用抗风湿药物，虽然生物制剂(如TNF-α拮抗剂)的应用使得更多患者受益，但RA的整体临床缓解率并没有显著提高，临床上仍有部分患者的病情难以控制，因此寻找新的治疗方法至关重要。

MSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，可来源于骨髓、脂肪和脐带组织，该细胞具有非特异性的免疫抑制和抗增殖作用，对多种自身免疫性疾病有潜在的治疗作用。在RA中，MSCs的治疗潜能越来越受到关注。MSCs在关节炎动物模型及RA中作用的研究也越来越多，大部分研究表明，骨髓来源的MSCs(BM-MSCs)能够阻止CIA鼠的关节炎进展并减少骨及软骨的破坏[13-15]，可治疗难治性RA[16]，但因抽取骨髓为侵袭性操作，供者难于接受，且BM-MSCs存在高度病毒污染的可能，并随年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力均出现明显下降趋势[17]。脐带来源的MSCs因取材方便、易于体外培养扩增等优点，目前已逐渐成为MSCs的首选来源。研究证实，UC-MSCs能抑制RA患者T细胞及FLS活化，用其治疗CIA模型动物可减轻实验动物的滑膜炎症和骨破坏。国内应用UC-MSCs静脉输注及关节腔注射治疗RA也取得良好效果，这提示UC-MSCs有可能成为RA的新疗法。

galectin-1是一个相对分子质量为14.5×103的蛋白质，由定位在染色体22q13.1的单基因编码，其结构较为简单，含有单一的糖类识别结构域。galectin-1是典型的细胞质蛋白，但在细胞表面、细胞外基质、胞质和核内均发现有它的表达，其与细胞表面复合糖上的β-半乳糖苷相结合，从而参与细胞黏附、生长调节和免疫反应等多种生物学功能。galectin-1被认为是免疫反应的负调节蛋白，可以抑制活化T细胞的增殖，促进其凋亡，抑制Th1型和Th17型细胞因子的分泌且促进Th2型细胞因子的分泌[7-8]。galectin-1与T细胞表面的CD7结合，激活AP-1活性并下调Bcl-2的表达可能是galectin-1诱导凋亡的分子机制[18]。有研究发现，galectin-1在RA发病中发挥负性调控的作用[19]。外源性给予galectin-1蛋白可减轻CIA的滑膜炎症和骨破坏。敲除小鼠galectin-1基因后再用Ⅱ型胶原(CII)诱导关节炎模型发现，Gal-1-/-鼠更易出现关节炎且炎症程度显著高于野生型鼠，血清中无galectin-1的鼠中IgG1和IgG2型抗CII抗体水平同样显著高于野生型鼠[20]。我们前期的研究发现，UC-MSCs高表达galectin-1，因此本研究采用慢病毒构建galectin-1低表达的UC-MSCs，观察galectin-1对UC-MSCs调控RA患者CD4+T细胞功能的影响。

A, flow cytometric staining of intracellular cytokines; B, the proportion of CD4 IFN-γ T cell. Group 1, negative control; Group 2, UC-MSCs-CD4 T; Group 3, UC-MSCs (negative control shRNA)-CD4 T; Group 4, UC-MSCs(Gal-1)-CD4 T. * P<0.05, compared with the negative control group.

图5 Galectin-1对UC-MSCs调控Th1细胞的影响

Figure5 Galectin-1 affected the inhibition effect of UC-MSCs on Th1 cell

本研究利用GV248慢病毒载体构建galectin-1-shRNA慢病毒，转染UC-MSCs，经PCR及Western blot鉴定其galectin-1的表达水平明显下调，成功建立了UC-MSC(Gal-1-)；再采用细胞直接接触方式将UC-MSCs及UC-MSC(Gal-1-)和CD4+T细胞共培养，检测galectin-1的表达不同对UC-MSCs抑制CD4+T细胞功能的影响。T细胞活化是RA发病的中心环节，MTS及ELISA结果显示，UC-MSCs可显著抑制PHA诱导的CD4+T细胞的增殖活化，而敲低galectin-1后此抑制作用显著减弱。本研究这一结果与文献报道一致，Najar等[9]的研究发现，下调BM-MSCs中galectin-1分子的表达后，其对T细胞的免疫抑制作用减弱，且T细胞活化后分泌的促炎性细胞因子水平降低。RA患者还存在Th1/Th2/Th17细胞的分化异常，RA患者体内存在Th1型细胞和细胞因子(如IFN-γ)表达的增加，提示Th1型CD4+T细胞在RA中发挥重要作用。本研究结果显示，UC-MSCs可显著下调RA患者Th1的比例，但敲低galectin-1后此抑制作用明显减弱，此外，UC-MSCs可上调RA患者Th2细胞比例并下调Th17分化，但差异均无统计学意义，考虑可能纳入例数较少且不同RA患者外周血中Th2及Th17的比例相差较大影响统计结果。

本研究证实，在体外，UC-MSCs可抑制RA患者CD4+T细胞的增殖活化，且显著下调Th1细胞比例，但敲低galectin-1分子的表达后该作用减弱，提示galectin-1参与了UC-MSCs抑制RA患者CD4+T细胞功能的过程。

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(2016-08-05收稿)

(本文编辑：任英慧)

Role of galectin-1 in regulation of umbilical cord mesenchymal stem cells on T cells of rheumatoid arthritis

SUN Lin, AN Zhuo, LI Chang-hong, LIU Rui, ZHAO Jin-xia, LIU Xiang-yuan△

(Department of Rheumatology and Immunology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

Objective： The therapeutic potential of umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) in rheumatoid arthritis (RA) has attracted more and more attention, because of it can suppress the various inflammatory effects of T cells. Galectin-1 is highly expressed in UC-MSCs, as the first lectin mediating the immunomodulatory effect of MSCs. Our study will investigate the effects of galectin-1 in regulation of UC-MSCs on rheumatoid arthritis T cells. Methods: Lentivirus transfected shRNA technique was used to knock down the expression of galectin-1 in UC-MSCs to construct UC-MSCs(Gal-1-). The effects of UC-MSCs and UC-MSCs(Gal-1-) on CD4+T cells in RA patients were investigated by contact system, including negative control group (CD4+T cells), positive control group [CD4+T-phytohemagg lutinin (PHA)], UC-MSCs-CD4+T cells co-culture group, UC-MSCs(control shRNA)-CD4+T cells co-culture group, and UC-MSCs(Gal-1-)-CD4+T cells co-culture group. The proliferation of CD4+T cells was detected by MTS assay. The level of tumor necrosis factors α (TNF-α) in cells supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effect of UC-MSCs on helper T cell (Th) subset was detected by flow cytometry. Results:Invitro, UC-MSCs were capable of inhibiting PHA induced proliferation of CD4+T cells from RA patients, but UC-MSCs(Gal-1-) did not show the significant inhibitory effect. Galectin-1 affect the TNF-α level of CD4+T cells regulated by UC-MSCs. UC-MSCs and UC-MSCs(control shRNA) significantly inhibited the expression of TNF-α in PHA-induced CD4+T cells. However, UC-MSCs(Gal-1-) had no significant inhibitory effect. Furthermore, the Th1 cells were also significantly suppressed by UC-MSCs and UC-MSCs(control shRNA) (4.83%±1.37% and 5.13%±0.87%，P=0.012 andP=0.018). These was no significant difference in the proportion of the Th1 cells between the control group and UC-MSCs(Gal-1-) group (8.51%±2.04% and 6.41%±0.96%，P=0.101). The Th2 cells were protected after silence galectin-1 in UC-MSCs, whereas there was no significant difference. The proportion of Th17 was decreased by co-culture with UC-MSCs and UC-MSCs(control shRNA), but these was also no significant difference. Conclusion: UC-MSCs can inhibit the proliferation and differentiation of CD4+T cells from RA patients, but these effect declined after knocking down the expression of galectin-1. Galectin-1 maybe take part in the regulation of UC-MSCs on rheumatoid arthritis CD4+T cells.

Arthritis, rheumatoid; Mesenchymal stem cells; Galectins

国家自然科学基金(81273293)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (81273293)

时间：2016-10-31 16：28：46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161031.1628.016.html

R593.22

A

1671-167X(2016)06-0964-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.008

△ Corresponding author’s e-mail, liu-xiangyuan@263.net