高效液相色谱技术在中药配方颗粒质量控制中应用现状

陈红林 杨捡美 汪兰 夏新华 黄本东 肖利辉 胡波 谭桂林

摘要：中药配方颗粒是中药饮片改革的新成果，在国内外有着广泛的应用前景。建立切实可行的中药配方颗粒质量控制标准是中药配方颗粒规范化、国际化的前提条件。高效液相色谱技术的不断发展，使其成为中药配方颗粒质量控制与评价中必不可少的技术手段。本文对近年来高效液相色谱技术在中药配方颗粒有效成分含量测定、指纹图谱建立、原药材鉴别及化学成分研究等方面的应用作一综述，为中药配方颗粒质量控制提供参考。

关键词：中药配方颗粒；高效液相色谱法；质量控制；综述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.034

中图分类号：R283.6 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0133-04

Application Status of HPLC Technology in Quality Control of TCM Dispensing Granules CHEN Hong-lin1，2， YANG Jian-mei1，2， WANG Lan1，2， XIA Xin-hua2，3， HUANG Ben-dong1， XIAO Li-hui1， HU-Bo1，2， TAN Gui-lin3 （1. Hunan Warrant Pharmaceutical Co.， Ltd， Changsha 410208， China； 2. Hunan Engineering Research Center of TCM Dispensing Granules， Changsha 410208， China； 3. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： TCM dispensing granules are new achievements in the reform of TCM and have a vast application prospect at home and abroad. A viable quality control standard is a prerequisite for the standardization and internationalization of TCM dispensing granules. With the continuous development of HPLC， HPLC has become an essential technique for quality control of TCM dispensing granules. This article reviewed the application of HPLC in dispensing granules， such as the determination of effective components， the establishment of fingerprint， the identification of the original materia medica and chemical components in recent years， in order to provide references for quality control of TCM dispensing granules.

Key words： TCM dispensing granules； HPLC； quality control； review

中药配方颗粒是以符合炮制规范的中药饮片为原料，经现代工艺提取精制而成的供临床调剂用的颗粒制剂，是传统饮片的补充形式。中药配方颗粒基于处方调配方便性和准确性而诞生，具有随证加减的优势和特色，克服了传统中药汤剂煎熬费时、服用不便、工艺粗放等缺点，顺应了现代社会对药物的基本要求，是中药饮片与时俱进的产物。

配方颗粒的出现在国内外有着广阔的市场前景，但在饮片原有性状与显微鉴别特征消失后如何控制其质量，是目前生产研究中的难点与热点。高效液相色谱法（HPLC）依托多种检测器及种类丰富的色谱柱，流动相选择广，适用性强，适合大多数中药成分的分离分析，成为中药质量评价研究中重要方法

通讯作者：夏新华，E-mail：xiaxinhua001@163.com

之一，在中药配方颗粒失去饮片外形后的质量检验与鉴别等方面具有应用优势。兹就HPLC技术近年在中药配方颗粒质量控制中的应用作一综述，为中药配方颗粒质量控制提供思路。

1 中药配方颗粒含量测定研究

有效成分的含量是影响中药药效的关键因素，建立必要的有效成分含量检测手段是质量控制的关键，同样在中药配方颗粒质量标准中有效成分的含量测定也不可或缺。中药所含化学成分复杂，其疗效是多组分、多靶点的综合表现，HPLC具有分离和测定的双重作用，在中药配方颗粒有效成分含量测定中不仅能对单一有效成分进行含量测定，还能建立起多指标成分的定量方法。

张氏等[1]采用HPLC测定甘草配方颗粒中甘草酸含量，采用Agilent Extend-C18柱，并对流动相系统进行比较和调整研究，在甲醇-0.2 mol/L醋酸铵系统中甘草酸分离效果较好，流速为1.0 mL/min，250 nm波长检测，甘草酸在0.492～7.872 μg呈现良好线性关系，方法精密度、重复性良好，测定结果准确。积雪草配方颗粒的活性成分积雪草苷属于紫外末端吸收的化合物，紫外检测器无法检测。曹氏等[2]首次采用HPLC-蒸发光散射检测器（ELSD）法测定了积雪草配方颗粒中积雪草苷的含量，积雪草苷在23.2～580 μg/mL范围内呈良好线性关系，此分析方法简便，且结果准确，适用于积雪草配方颗粒剂的质量控制。而在玄参配方颗粒研究中，3种主要成分哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸在高效液相单一波长下同时检出干扰较大，定量误差大。周氏等[3]通过紫外吸收波长考察发现，210、278 nm双波长检测能准确定量三者含量，故可为玄参配方颗粒的质量控制及标准研究提供参考依据。

除小檗碱外，巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱等生物碱也是黄连的主要有效成分。在仅有小檗碱一个对照品的基础上，刘氏等[4]通过高效液相一测多评法实现了黄连配方颗粒中上述成分的同步含量测定。在线性范围内，成分的量与检测器响应成正比，以小檗碱为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，计算其他组分含量，建立了黄连配方颗粒一测多评的多指标质量控制方法。在对三七配方颗粒4种皂苷R1、Rg1、Re、Rb1进行HPLC分离时，李氏等[5]采用了溶剂/流速双梯度-整体柱的方法。三七中Rg1和Re同属于20（S）-原人参三醇类，结构性质相近，而R1和Rb1极性相差较大，应用一般的十八烷基填充柱因柱压限制难以对4个组分进行分离，且耗时长，因此李氏等[5]采用整体柱，通过对乙腈浓度、流速进行双梯度优化，20 min内完成了三七配方颗粒中4种皂苷成分质量分析。在建立炒苍耳子配方颗粒多成分质量控制标准研究中，Chen B等[6]运用超高效液相色谱，采用小粒径填料的Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），选取炒苍耳子中与临床抗炎疗效相关的5种酚酸类成分——新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸和洋蓟素作定量分析，10 min内实现了此5种绿原酸类化合物的同时测定，分析时间短，准确性高。此外，另有应用HPLC分别对配方颗粒银翘散[7]、荷叶[8]、紫花地丁[9]中有效物质含量进行了测定，为上述配方颗粒质量控制提供了简便、快速、可行的检测方法。

2 中药配方颗粒指纹图谱研究

在中药配方颗粒质量控制研究中，其多组分的特性，要求采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法评价质量。指纹图谱是近年迅速发展起来的中药质量控制模式中的一种，是建立在中药化学成分系统研究基础上，能较全面反映中药中所含化学成分种类与含量，进而对质量进行整体描述和评价的方法。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，指纹图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。HPLC能实现中药中绝大多数成分的分离分析检测，在中药配方颗粒的指纹图谱的研究中，HPLC技术应用最为广泛。

梁氏等[10]采用HPLC-线性梯度洗脱法对12批不同厂家虎杖配方颗粒进行研究，通过采用SunFire C18色谱柱，乙腈-0.05%磷酸溶液1.0 mL/min流速梯度洗脱，230 nm波长检测，确定了14个共有峰，且相似度评价均大于0.98，获得的指纹图谱稳定可靠，为虎杖配方颗粒质量控制和评价提供了参考。陈氏等[11]对淫羊藿、骨碎补等单味配方颗粒按处方量混合制成的补肾壮骨配方颗粒HPLC指纹图谱进行了研究，采用Inertsil C18柱，乙腈-水梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长285 nm，柱温30 ℃。10批样品共标定了9个共有峰且相似度>0.930，获得的图谱可清晰反映主要药味骨碎补与淫羊藿药材指纹特征。超高效液相色谱较常规HPLC峰容量、灵敏度、分析效率及分辨率有很大提高。在三七配方颗粒指纹图谱分析研究中，胥氏等[12]采用超高效液相色谱法，Agilent poroshell 120EC C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，203 nm波长检测，提高了工作效率，超高效液相建立的三七配方颗粒的指纹图谱只需23 min，为中药配方颗粒的快速质量控制提供了可靠的方法。应用HPLC对中药配方颗粒进行指纹图谱的研究[13-15]，为配方颗粒全面和整体的质量评价提供了参考。

3 中药配方颗粒鉴别研究

中药配方颗粒的原材料鉴别、真伪鉴别、优劣鉴别等是控制配方颗粒质量的有效途径，目前HPLC技术在该方面研究相对较少。苏氏等[16]对黄连中的川连（味连、雅连）及云连配方颗粒进行了HPLC分析，结果云连的色谱图与味连和雅连有明显差别，云连缺少表小檗碱的色谱峰，据此可鉴别川连（味连、雅连）和云连，从而对药材来源进行鉴别。王氏等[17]对白鲜皮配方颗粒的HPLC特征图谱进行了研究，选择了Megres5-C18色谱柱（Hanbon，250×4.6 mm，5 μm），用二极管阵列检测器（DAD）记录白鲜皮配方颗粒样品溶液的三维吸收图，发现在228 nm左右可检测到最多的色谱峰，同时主要有效成分黄柏酮和梣酮均可得到较好的检测，以乙腈-0.1%磷酸系统进行梯度洗脱，流速1 mL/min，6个共有峰组成了白鲜皮配方颗粒的特征图谱，共有峰具有专属性，相对保留时间比较稳定，为白鲜皮配方颗粒质量控制提供了检测依据，可用于鉴别白鲜皮配方颗粒的真伪。杨氏等[18]对半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征图谱进行研究，通过HPLC梯度洗脱建立半夏及其炮制品姜半夏的水及75%、95%乙醇提取部位的特征图谱，分别建立了半夏及其炮制品姜半夏不同部位的HPLC特征图谱共有模式，确认了肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸、盐酸麻黄碱、6-姜辣素6个特征峰。与半夏HPLC特征图谱相比，姜半夏在保留时间18.3、73.5 min附近新增2个峰（10号峰、19号峰6-姜辣素），首次建立了半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位HPLC特征图谱。该方法稳定、简便、可靠，可有效控制半夏及姜半夏饮片的质量。

4 中药配方颗粒化学成分研究

化学成分是药物发挥作用的基础，HPLC高效的分离特性结合质谱（MS）强大的结构表征能力，为中药提取物快速确定已知化合物，以及鉴别未知化合物或微量成分提供了有效方法，为中药配方颗粒化学成分快速分离鉴别创造了条件。

Li S L等[19]以三黄泻心汤为例，采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-飞行时间质谱法（UPLC-PDA-TOF/MS），快速对传统汤剂和配方颗粒进行了全成分分析，总共鉴定出了39种化合物。利用最小二乘判别分析（OPLS-DA）对差异成分进行鉴别，发现合煎汤剂小檗碱、巴马汀、表小檗碱、黄芩苷、wonogoside和2-O-golloyl-1-O-cinnamoylglucose明显降低，而大黄素明显升高。Ma C H等[20]采用UPLC-PDA-TOF/MS技术对三拗汤配方颗粒和传统汤剂化学成分一致性进行对比分析，总共鉴定了42个化合物，其中麻黄碱、伪麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甘草苷G2、甘草苷H2，苦杏仁苷等14个化合物在煎煮过程中发生了改变。Shang E X等[21]通过UPLC-QTOF-MS技术对桃红四物汤配方颗粒与传统汤剂的化学成分对比研究，发现芍药内酯苷、芍药苷、没食子酸、苦杏仁苷和羟基红花黄色素A在两者含量上具有显著差异，并提出用线性回归分析对配方颗粒的用量比例进行优化，将桃红四物汤（当归∶川芎∶白芍∶熟地黄∶桃仁∶红花）配方颗粒比例调整为2.5∶0.2∶1∶0.5∶0.6∶0.1，以保持配方颗粒与传统汤剂成分含量的一致。

5 其他应用

Zhang X L等[22]将HPLC及UPLC-PDA-QTOF- MS/MS技术用于快速寻找配方颗粒质量控制的特征化学标记物，以川芎配方颗粒为例，首先对川芎生药材、传统煎剂及配方颗粒HPLC指纹图谱进行了构建，采用中位数法产生对照指纹图谱，找出其特征峰，进一步利用液质联用技术对特征峰进行鉴定，从而找出特征成分并进行定量分析，川芎中3个主要峰成分鉴定为阿魏酸、川芎内酯I和川芎内酯H。定量结果显示，阿魏酸及川芎内酯H含量低于1.0 mg/g，川芎内酯I含量为4.40 mg/g，适合作为川芎配方颗粒质量控制的定量标志物，而阿魏酸及川芎内酯H则作为配方颗粒质量评价的定性指标，此方法为其他中药配方颗粒的质量评价指标的建立提供了参考。Chen H G等[23]采用HPLC-二极管阵列检测器-蒸发光检测器（HPLC-DAD-ELSD）联用技术，结合药效学和血清药物化学的方法，对黄芪配方颗粒进行质量评估。黄芪颗粒灌胃大鼠之后对血液进行鉴定发现毛蕊-7- O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷、芒柄花素能够吸收入血，指定这五者作为生物标志物对黄芪颗粒进行质量控制，通过HPLC-DAD- ELSD联用技术实现了这5个成分的同时定量。

6 展望

中药配方颗粒是中药饮片新形式改革的产物，是中药饮片现代化的成果，建立严格的质量标准保证其安全性、有效性是一项长期而艰巨的任务，也是实现中药现代化的重要基础和关键。

在配方颗粒质量控制研究中，HPLC在技术层面上提供了有力支持。随着更小颗粒填料色谱柱和超高压输液泵的使用，HPLC向着超高效液相色谱技术的发展，分离分析速度大大提高；HPLC与质谱联用，更实现了对微量成分检测和未知成分的鉴别。HPLC技术的发展能够满足现代中药研究中对高效能分析仪器的迫切需要，对我国中药科学研究和质量监测具有重大意义。目前HPLC在中药配方颗粒质量控制研究中以有效成分含量测定和建立指纹图谱为主。随着高效液相色谱仪与多种检测器联用技术，多波长检测技术以及“一测多评”等方法的发展，越来越多的配方颗粒含量测定向着多指标成分定量的中药质量控制模式发展。中药多成分的特点也使其质量控制体系立足于中药特色，越来越多的中药配方颗粒指纹图谱得以建立，确保其质量，做到国际认可。HPLC同高分辨质谱的联用结合药效学指标更为中药配方颗粒指纹图谱基础之上的“谱效相关”质量控制模式的建立提供了强有力的支持。

此外，中药外源性有害物质如重金属、农药残留等一直是国际社会关注的焦点，目前中药材及中药饮片安全研究报道中，HPLC技术的应用也较为普遍[24-25]，但在中药配方颗粒中尚无相关研究，今后可在配方颗粒中进行相关限量检测，为配方颗粒规范化提供更加系统的研究思路。总之，HPLC技术的不断发展使其在中药配方颗粒质量控制中成为一种必不可少的分析手段，解决了诸多传统质量控制方面的技术问题，为建立专属性强的鉴别方法和更加客观的质量评价方法提供了技术支持，其应用能够对原药材、中间产品、成品全程监控，以便更好地保证中药配方颗粒安全、稳定、有效。笔者建议，中药配方颗粒的研发单位及生产企业应加强技术合作与交流，采取切实可行的办法解决中药配方颗粒失去饮片外形后其品种的真伪鉴别和质量评价技术问题，为中药配方颗粒的健康发展提供一个新的研究技术平台。

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（收稿日期：2015-10-13；编辑：梅智胜）