重组病毒在循环肿瘤细胞检测中的应用及研究进展

李悦国 宗晓龙 霍茜瑜 徐锦富 李文正 杨灵敏 谷雅君

300060 天津医科大学肿瘤医院检验科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心(李悦国)；300211 天津医科大学第二医院检验科(宗晓龙)；300203 天津医科大学医学检验学院(霍茜瑜、徐锦富、李文正、杨灵敏、谷雅君)

·综述·

重组病毒在循环肿瘤细胞检测中的应用及研究进展

李悦国 宗晓龙 霍茜瑜 徐锦富 李文正 杨灵敏 谷雅君

300060 天津医科大学肿瘤医院检验科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心(李悦国)；300211 天津医科大学第二医院检验科(宗晓龙)；300203 天津医科大学医学检验学院(霍茜瑜、徐锦富、李文正、杨灵敏、谷雅君)

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)是液体活检的重要手段之一，也是非侵入性的个体化实验诊断工具。以FDA首个批准的CTCs检测平台CellSearch为代表的商品化CTCs分离平台已被证实可有效富集监测CTCs，但出现上皮—间质转化的CTCs因不表达上皮细胞粘附分子而可能被漏检。此外大多CTCs检测平台因无法区分活细胞和死细胞而不能有效反映CTCs功能状态，因此如何利用常规设备开发新型分离方法用于检测具有转移潜力的CTCs具有更加重要的现实意义。插入人端粒酶启动子和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的复制选择性溶瘤病毒，主要为单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)和腺病毒(Adenovirus, ADV)具有特异示踪CTCs的作用。肿瘤细胞感染重组病毒24 h后稳定表达GFP，通过荧光显微镜或流式细胞仪直接检测荧光信号即可对CTCs进行计数，结合PCR、测序等方法亦可进行相关下游分析。此外，通过基因工程改造的复制选择性溶瘤病毒仅在活细胞中生长繁殖，有利于在早期发现具有转移潜能的高活性CTCs。以重组病毒为基础的CTCs检测方法灵敏准确、简便易行，具有较好的临床应用前景。

肿瘤转移是癌症致死的主要原因，也是恶性肿瘤发生发展过程中的关键事件。越来越多的研究表明，存在于外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)是恶性肿瘤患者出现远端转移和术后复发的重要原因[1-2]。CTCs存在于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中，它作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”为肿瘤患者实施实时、微创性的早期筛查提供了重要资源[3-4]。此外，CTCs监测也有助于发现肿瘤转移、判断预后，从而为指导患者个体化治疗提供科学依据[5]。

基于CTCs数量少、分离难的特点，如何有效地富集出高纯度、有活力的靶细胞是临床工作者和科研人员面临的重大挑战。目前常见的CTCs检测平台主要有利用抗原抗体反应的免疫亲合法和基于CTCs大小、密度、介电性能等的物理方法两大类。以美国食品药品监督管理局(FDA)首个批准的CTCs检测平台CellSearch为代表的商品化分离平台已被证实可有效富集监测CTCs，然而基于免疫亲合法的抗体捕获方式局限性较大，被富集的细胞可能来自其他上皮组织而非肿瘤细胞，此外出现上皮—间质转化的CTCs因不表达上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)而可能被漏检。物理分离法对细胞形态和活性影响较小，表面抗原或分子均无破坏，为后续的检测提供了良好条件，但肿瘤细胞在时间和空间上的异质性导致富集CTCs的纯度低、准确性差，且需要配合PCR、FISH、免疫荧光、单细胞测序等方法进行二次鉴定。因此开发新型CTCs分离检测方法是临床及科研人员亟待解决的重要问题。

1 应用重组病毒检测CTCs技术

随着分子生物学的发展，通过基因改造和构建重组病毒使其具有特异识别肿瘤细胞的能力逐渐成为肿瘤领域的研究热点。在液态活检方面，已有报道主要集中在以单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)和腺病毒(Adenovirus, ADV)为代表的复制选择性溶瘤病毒(Replication selective oncolytic virus, RSOV)。RSOV能够选择性感染肿瘤细胞并在胞内复制，进而杀伤肿瘤细胞并不断释放新病毒感染临近细胞，而对正常细胞无影响[6]。HSV具有广谱感染肿瘤细胞的作用，能够在活细胞中生长繁殖，一般不感染正常人血细胞，构建表达HSV-GFP重组病毒检测CTCs的假阳性率较低。ADV因其性质稳定、作用范围广泛，感染细胞高效性、低毒性等特点在以基因治疗为代表的生物医学研究中亦得到了广泛应用[7-9]。为提高重组病毒捕获CTCs的特异性，可以利用端粒酶启动子调控病毒在肿瘤细胞内的复制，进而在感染病毒的CTCs中表达GFP。

研究表明，超过90%的恶性肿瘤出现端粒酶激活的现象，使得端粒维持在一定长度，成为肿瘤细胞无限增殖的动力，而正常人类组织细胞端粒酶则呈无活性或被抑制状态[10-11]。人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶成分中的限速亚基，也是端粒酶活性调节的关键基因。将病毒复制过程中关键基因的启动子替换为hTERT启动子，并在下游连接GFP表达盒。待重组病毒转染细胞后，即可在hTERT转录环境的作用下激活下游GFP的表达用于CTCs示踪，通过荧光显微镜或流式细胞仪直接检测荧光信号即可对CTCs进行计数。

2 重组HSV在CTCs检测中的应用

已有病例报道病毒疫苗或天然病毒感染后可导致肿瘤消失[12]。单纯疱疹病毒经过特殊改造后，具有特异性感染和破坏肺癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食管癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌、间皮瘤等肿瘤细胞的作用。Fong等[13]利用病毒NV1066构建了表达GFP的HSV重组病毒，联合荧光显微镜和流式细胞仪检测CTCs，其特异性可达100%，远高于传统基于抗体检测CTCs的方法。

韩香萍等[14]建立了一种表达GFP的HSV溶瘤病毒用于快速检测CTCs。将10、100、1 000、10 000个人肺癌细胞PG分别加入到2 ml外周血中，通过淋巴细胞分离液富集单个核细胞后，以感染复数为1的HSV-GFP感染待检细胞，荧光显微镜观察发出荧光的细胞即为CTCs。应用该法可以在仅加入10个肿瘤细胞的2 ml外周血中检测出阳性结果，其敏感性可达10-6。在70例不同恶性肿瘤患者的外周血、脊髓、胸水或腹水样本中，HSV-GFP法检出40例阳性。在15例具有细胞学检测结果的样本中，4例细胞学检测呈阳性，而HSV-GFP法检测阳性有11例；其它细胞学检测阳性的4例样本，HSV 检测均为阳性。

阴丽媛等[15]将HSV复制过程中关键基因ICP4启动子替换为hTERT启动子，并在下游连接GFP表达盒用于构建重组病毒oHSV1-GFP。收集EDTA抗凝外周血4 ml，经红细胞裂解液预处理后，按照感染复数为1的比例转染oHSV1-GFP 24 h后收集细胞，流式细胞仪检测CD45-/GFP+的细胞即为CTCs。应用该法检测26例原发性肝癌患者及50例健康人外周血显示，肝癌患者外周血中的CTCs显著高于健康人(16.7±2.77 vs 0.94±0.12，P<0.0001)。

Zhang等[16]利用oHSV1-hTERT-GFP重组子在326例肿瘤患者外周血样本中检测到59%～100% CTCs阳性，包括76.5% (52/68)肺腺癌、84.2% (16/19)鳞状细胞癌、69.2% (9/14)小细胞肺癌、75% (51/68)结直肠癌、86.2%(25/29)胃癌、59% (23/39)神经胶质瘤、91.6% (33/36)肝细胞癌和88.2%(15/17)胰腺癌。

3 重组ADV在CTCs检测中的应用

基于端粒酶的ADV由hTERT启动子元件控制病毒复制，其下游CMV启动子驱动GFP的表达。因此端粒酶活性高的肿瘤细胞诱导大量病毒复制并表达GFP。Xu等[17]构建了表达GFP的ADV载体，其检测体外培养的黑色素瘤细胞的灵敏度达88.7%(95%CI: 85.6%～90.4%)，特异性为99.9%(95%CI: 99.8%～99.9%)。在10例转移性肿瘤患者外周血标本中，检测出9例CTCs阳性，均值为6.0个/ml。

2009年，Kojima等[18]构建出表达GFP的端粒酶特异性复制选择性ADV(OBP-401, TelomeScan)，其中hTERT启动子调节内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)连接的E1A和E1B基因，gfp基因在CMV启动子控制下插入OBP-401的E3区域。经过红细胞裂解、病毒转染和荧光观察三个步骤，可成功观察到被重组病毒感染后呈绿色荧光的CTCs。应用该法在70.3%胃癌标本中检测到1个以上的CTCs(n=26，0～47个CTCs)。在9例包括结肠癌、肝细胞癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等其他恶性肿瘤中，CTCs阳性率达到66.7%(0～56个CTCs)。

Shigeyasu等[19]利用OBP-401分选上皮、基质或上皮基质转化的CTCs后。收集5 ml外周血样本，裂解红细胞后，以1×106转染OBP-401并孵育24 h，采用PE标记的抗CD-45抗体处理后经流式细胞仪检测CTCs。后续通过直接测序或突变特异性PCR可准确检测到结直肠癌患者外周血样本中的KRAS、BRAF和KIT基因突变，为辅助临床医生实施个体化治疗提供科学依据。

4 重组病毒在CTCs检测中的局限性及解决方案

目前应用重组病毒检测CTCs的方法尚处于起步阶段，因此存在一定的不足之处。王云等[20]通过构建oHSV1-hTERT-GFP重组病毒亦检测到正常人外周血中存在少量CD45-/GFP+细胞。其主要原因是在健康人群外周血中，有极少量活化的淋巴细胞具有端粒酶活性[21]。为解决该问题，Takakura等[22]在OBP-401重组ADV转染细胞后，加入了抗CD45荧光抗体用于标记外周血白细胞，有效克服了重组病毒检测CTCs的非特异性现象。Yabusaki等[23]在重组病毒转染细胞后，引入细胞直径大于8.4 μm用以排除白细胞的步骤，在86个肿瘤外周血样本中筛选出43%的阳性CTCs。Ito等[24-25]将细胞直径临界值设定在7.735 μm，在胃癌患者中GFP阳性的CTCs与总生存期有显著相关性。总之，在外周血样本经红细胞裂解、重组病毒转染后，利用荧光标记二抗或根据细胞直径进一步鉴定CTCs可有效提高重组病毒捕获肿瘤细胞的特异性。

5 小结与展望

早在1960年，以西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)和麻疹病毒(Measles virus, MeV)为代表的天然病毒开始被用于肿瘤治疗[26]。随着基因工程技术的进展，由于重组复制选择性溶瘤病毒可特异地感染并破坏肿瘤细胞而逐渐被用于CTCs示踪。以HSV和ADV为代表的复制选择性溶瘤病毒插入人端粒酶启动子和GFP基因后能够稳定表达GFP，可特异性追踪并分离CTCs。重组病毒检测CTCs的方法克服了传统基于EpCAM抗体检测CTCs可能漏检上皮—间质转化的肿瘤细胞。另一方面，重组复制选择性溶瘤病毒示踪CTCs可区分活细胞和死细胞进而有效反映具有转移潜能的CTCs亚群。此外，重组病毒分选得到的CTCs联合药敏试验、细胞化学染色、单细胞测序等下游检测在指导临床用药、个体化治疗等方面具有巨大应用潜力。

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Detectionofcirculatingtumorcellsbyrecombinantvirus

LiYueguo,ZongXiaolong,HuoQianyu,XuJinfu,LiWenzheng,YangLingmin,GuYajun

DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital.NationalClinicalResearchCenterforCancer.KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy.Tianjin’sClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China(LiYG);MedicalLaboftheSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211,China(ZongXL);SchoolofMedicalLaboratory,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300203,China(HuoQ,XuJF,LiWZ,YangLM,GuYJ)

GuYajun,Email:yajun_gu@126.com

The detection and molecular characterization of circulating tumor cells(CTCs) is one of the most important tool for liquid biopsy, which has the potential to enable non-invasive diagnostic tests for personalized medicine. Commercial platforms represented by CellSearch, the first FDA approved assay, have been considered to be valid for CTCs detection. However, special equipment and consumptive materials are required in the techniques listed above. Besides, most of them can not differentiate between apoptotic and viable cells, which indicates the portion of active and functional CTCs. Therefore, how to develop novel method for CTCs enrichment with metastatic potential has great significance in clinical routine. Telomerase-specific replication-selective oncolytic viruses expressing green fluorescent protein(GFP), including herpes simplex virus and adenovirus, allow the detection for human CTCs in the peripheral blood. After 24 h of transfection with recombinant virus, the tumor cells stably express GFP, and it could be used for CTCs counting by fluorescent microscopy or flow cytometry. Moreover, downstream analysis would be achieved by combination with PCR or DNA sequencing. Recombinant virus enables early detection of metastatic tumor cells, because the fluorescent signal is amplified only in viable, infected CTCs, by viral replication. This GFP-expressing virus-based method is remarkably sensitive, simple, and feasible, and it offers a new opportunity to detect and characterize CTCs in clinical routine.

Circulating tumor cells; Herpes simplex virus; Adenovirus; Green fluorescent protein; Telomerase

循环肿瘤细胞；单纯疱疹病毒；腺病毒；绿色荧光蛋白；端粒酶

2017-03-25)

(本文编辑：吕新军)

谷雅君，Email：yajun_gu@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.022

国家自然科学基金(81601820)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCQNJC11600、15JCYBJC27400)；天津市高等学校科技发展基金计划项目(20140124)

Fundprograms: National Natural Science Foundation(81601820); Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(15JCQNJC11600,15JCYBJC27400); Tianjin City High School Science & Technology Fund Planning Project (20140124)