基于金纳米颗粒负载的金属有机骨架材料的癌胚抗原传感器的研制

白茹燕+张坤蕾+李德蕾+张茜+刘婷知+刘仪+胡蓉+杨云慧

摘 要 以负载Au的金属有机骨架材料（AuNPs/Cu.TPA）标记CEA抗体（Ab2）为信号探针，通过电还原的方法将氧化石墨烯还原到电极上，研制了一种捕获CEA抗体（Ab1）的电化学免疫传感器，并将其应用于癌胚抗原（CEA）检测。所合成的MOFs材料中含有大量Cu2+， 且电化学信号比较稳定，因此可以通过检测MOFs材料中Cu2+的信号实现对CEA的检测。此信号探针不需要预处理和酸处理，易负载贵金属从而固定抗体，大大简化了检测步骤并缩短了检测时间。此传感器对CEA的检测灵敏度好，操作简便。在最优实验条件下，此传感器的线性范围为0.1～80 ng/mL，检出限为0.03 ng/mL，线性相关系数为0.9887，可用于真实样品中CEA的测定。

关键词 癌胚抗原； 金属有机骨架材料； 电化学免疫传感器

1 引 言

肿瘤标记物（Tumor marker）是肿瘤细胞产生的，含量远高于正常细胞的特异性物质。癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen， CEA）是一种参与细胞粘附的糖蛋白，通常是在胎儿发育过程中产生。1965年，Gold等从结直肠腺瘤和胎儿肠中首次分离出CEA[1]。在健康成年人血清中，CEA含量通常很低，在正常组织中，CEA主要分布在胃肠道上皮细胞中。在肿瘤组织中，CEA不仅在结直肠癌中表现出来[2]，而且在其它类型的癌症，如胃癌[3]，肺癌[4]、乳腺癌[5]、甲状腺癌[6]等癌症中也表现出来。因此癌胚抗原成为目前公认的一种肿瘤标志物，它的临床检测在评估病变范围、预测疗效、监测复发等方面具有较高参考价值[7]， 检测CEA有助于提高肿瘤患者的诊断率，监测肿瘤早期转移，并可为患者根治性手术后是否进行辅助化疗、疗效判断、复发转移等具有一定的指导意义，对患者的病情预后判断有着至关重要的临床意义[8]。常用的CEA的检测方法有实时荧光极化免疫测定法（FPIA）[9]、酶联免疫吸附测定法（ELISA）[10]、放射免疫测定（RIA）[11]、免疫金标技术[12]等方法。但是，荧光免疫测定法的应用范围比较窄，仪器成本较高，而酶联免疫吸附测定法灵敏度不高，放射免疫分析法自身存在放射污染，免疫金标技术法操作较复杂[13]。这些传统方法需要具有专门技术的操作人员，限制了这些方法在普通实验室的应用，难以实现快速检测。电化学免疫传感器由于具有操作程序简单、易于集成化、灵敏度高、成本低等优点， 已广泛应用于肿瘤标记物的检测。随着电化学免疫传感器的日趋成熟， 现代检测技术也将向微型化、集成化的方向发展[14]。

近年来，性能优良的新型金属有机骨架材料（Metal.organic frameworks，MOFs）成为研究者关注的热点[15]。 Cu.MOF由苯环有机连接体和含Cu2+的金属羧酸配合物团簇组成，含有四方形配位结构，是一类比表面积大，且具有纳米级规整孔道结构、呈多维网状结构的多孔材料[16]。这种材料的优良特性促使其迅速发展， 并成为材料、化学、环境领域的研究热点，在氢气储备、催化反应、气体吸附与分离及电化学传感器等应用领域有着广阔的研究和应用前景[17，18]， 其结构如图1所示。Cueto等[19]以对苯二甲酸和Cu（NO3）2合成了Cu（tpa）·3（H2O） （Cu.TPA），由于其合成方法与MOF.2[20]相似，所以结构类似于MOF.2（Zn.BDC），是一种多孔四方锥形材料，但其性质有异于MOF.2。Cu.TPA表现出更高的表面积，它在气体分离和存储和以及催化方面具有较高的应用价值[21]。

虽然金属离子已被用作信号标记物，但制备过程普遍费时，如Gao等[22]利用Cu2 +作为标记物检测树状大分子聚合DNA的电化学信号。本研究表明，Cu.TPA材料中的Cu2+氧化还原峰比较稳定，可单独作为一个信号基团，因此将这种Cu.TPA材料用作信号探针，Cu2+的电化学信号可以在缓冲溶液中很容易地检测出来。此新型信号探针不同于传统的探针，它不需要用酸溶解富集进行检测，因此极大地简化了检测步骤。此外，由于金属纳米颗粒可以很容易掺入MOFs中，使得随后偶联抗体的步骤也较简单稳定。鉴于这种信号探针的独特的性能，用其构建新型CEA电化学传感器对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Cu（NO3）2·3H2O（天津市风船化学试剂科技有限公司）； 对苯二甲酸（C 8H 6O4，萨恩化学技术（上海 ）有限公司）； N，N.二甲基甲酰胺（DMF，西陇化工有限公司）； CEA酶联免疫（ELISA）试剂盒及纯化CEA抗体（anti.CEA）购于郑州博赛生物技术股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA，美国Sigma.Aldrich公司）；氯金酸（HAuCl4，昆明铂锐金属材料有限公司）； 冰醋酸（CH3COOH，成都化学试剂厂）； 醋酸钠（CH3COONa， 麦克林试剂有限公司）； 无水乙醇（成都格雷西亚化学技术有限公司）；所有试剂均为分析纯，所用水为去离子水。

JEM.2100透射电镜仪（TEM，日本电子株式会社）； S.3000N扫描电子显微镜 （SEM， 日本Hitachiscience Systemsltd公司）； DX.2700X射线粉末衍射仪 （丹东方圆仪器有限公司）； CHI660D电化学工作站（上海辰华公司）。实验中采用三电极体系。

2.2 实验方法

2.2.1 Cu.TPA材料的合成 参照文献[21]合成Cu.TPA。将0.5265 g Cu （NO3）2·3H2O和0.724 g对苯二甲酸溶解在43.5 mL N，N.二甲基甲酰胺中，溶液变成蓝色；将所得溶液转移到高压反应釜中，于110℃下反应36 h，自然冷却，用无水乙醇洗涤3次，于80℃真空干燥12 h， 即制得Cu.TPA。

2.2.2 金纳米颗粒的合成 参照文献[23]合成金纳米颗粒。将 500 μL 1% HAuCl4 加入到50 mL 去离子水中，搅拌加热至沸腾，快速向沸腾溶液中加入2 mL 1%柠檬酸三钠，继续搅拌20 min，等到溶液变为酒红色，冷却至室温，即可得到金纳米颗粒。

2.2.3 AuNPs/Cu.TPA复合材料的合成 取50 mg Cu.TPA粉末溶于15 mL金纳米颗粒溶液中，室温搅拌12 h，溶液由蓝色变为淡粉色。将反应产物离心分离，60℃真空干燥6 h。

2.2.4 AuNPs/Cu.TPA复合材料标记CEA抗体 取2 mg AuNPs/Cu.TPA复合材料溶于1 mL去离子水中，用0.2 mol/L Na2CO3调节溶液至pH 9，取10 μL 1 mg/mL CEA抗体分5次加入（每隔3 min加一次，每次2 μL ）上述溶液中进行标记，然后将溶液在室温下振摇反应2 h ，加入10% BSA 25 μL，继续振摇反应30 min 以封闭剩余的活性位点。将所得溶液以5000 r/min低温离心5 min，用PBS溶液洗涤2次，分散在1 mL Eluent 缓冲溶液中，4℃保存备用。

2.2.5 免疫传感器的制备 将玻碳电极（Φ=3 mm）在金相砂纸上打磨后，用 Al2O3粉末将电极表面抛光，依次用HNO3（1∶1）、无水乙醇、蒸馏水各超声洗涤电极5 min。晾干后，参照文献[24] 方法还原氧化石墨烯，即将玻碳电极浸入到含有氧化石墨烯的电解质溶液中，通过循环伏安法，将分散液中的氧化石墨烯直接进行电化学还原并沉积在裸电极表面，电压扫描范围为

1.5～1.0 V。在晾干后的沉积有还原石墨烯（rGO）的电极上滴加30 μg/mL CEA抗体10 μL，4℃过夜。将此免疫传感器用0.01 mol/L PBS溶液滴洗3次，晾干后在37℃下用牛血清白蛋白（1% BSA） 封闭1 h，以封闭电极上的非特异性结合位点。滴加一定浓度的CEA抗原孵育50 min，冲洗后滴加10 μL AuNPs/Cu.TPA复合材料标记过的CEA抗体培育50 min，制得免疫传感器（见图2）。

2.2.6 检测方法 将在不同浓度CEA抗原溶液中培育过的免疫传感器放入10 mL HAc.NaAc缓冲溶液（0.2 mol/L， pH 4.5）中，连接好三电极体系，在0.3～

0.4 V电位范围内采用示差脉冲伏安法（DPV）进行检测，振幅50 mV， 脉冲时间0.05 s，脉冲周期0.2 s。实验结束后， 用0.01 mol/L PBS清洗电极，并置于4 mol/L尿素溶液中搅拌浸泡30 min， 洗脱电极上结合的抗原，使电极再生。当电极不用时，于4℃保存。

3 结果与讨论

3.1 Cu.TPA材料的表征

3.1.1 Cu.TPA材料的XRD表征 对合成的Cu.TPA材料进行了X射线粉末衍射表征， 并与文献[18]及XRD数据库所得的Cu.TPA单晶数据图进行对比，如图3所示。得到的衍射面数据分别为（110）， （001）， （020）， （11， （20

1）， （021）， （111）， （130）， （131）。经过实验值计算，证实本实验所合成的材料Cu.TPA与文献[18]报道的一致，为MOF材料。

3.1.2 Cu.TPA微观形貌表征 采用扫描电镜、透射电镜表征了Cu.TPA的微观形貌结构。从图4可见，Cu.TPA呈均匀的棒状，长度约为200 nm。

3.1.3 Cu.TPA/AuNPs材料的表征 为了确定AuNPs/Cu.TPA的微观形貌结构，采用TEM对其形貌进行了表征。从图5可以清晰看出AuNPs被均匀地负载到 Cu.TPA材料上。

3.2 氧化还原峰电流与扫描速度的关系

为进一步了解AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫传感器的电化学行为，实验还考察了扫描速度对AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE的峰电流的影响，当扫描速度在10～100 mV/s 范围内变化时，传感器在HAc.NaAc缓冲溶液 （0.2 mol/L，pH 4.5）中的循环伏安行为如图6所示，峰电流与扫描速度的平方根成正比，说明该电化学反应过程受扩散控制，这可能是因为在合成Cu.TPA过程中，Cu的价态发生了改变。然而，阴极峰电流较小，说明此电化学过程是不可逆的[25]。

3.3 不同修饰电极界面的交流阻抗行为

交流阻抗常被用于表征电极修饰过程。 图7为不同修饰电极在5 mmol/L K3Fe（CN） 6/K4Fe（CN） 6溶液中的交流阻抗图。曲线a为裸玻碳电极的阻抗图，近似呈直线，说明电子传递几乎没有阻碍；曲线b为修饰了石墨烯后玻碳电极的阻抗图，阻抗改变很小。曲线c为固定抗体在修饰了石墨烯的玻碳电极上的阻抗图，阻抗有所增加（R et=500 Ω），这是由于不导电的抗体阻碍了电子在电极表面的传递，说明抗体已固定在电极表面上。曲线d是培育CEA抗原后的电极的交流阻抗图，与曲线c相比，半圆直径显著增大（R et=700 Ω），这是由于抗体和抗原的特异性结合阻碍了电子的传递。曲线e是培育了AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA之后的电极交流阻抗图，阻抗值进一步增大（R et=1450 Ω），这说明免疫复合物对电子的阻碍作用增强。

3.4 实验条件优化

3.4.1 缓冲溶液pH值对传感器峰电流的影响 溶液的pH值会影响标记材料中Cu的峰电流信号，从而影响免疫传感器的检测，实验考察了pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的HAc.NaAc缓冲溶液对标记抗体材料中Cu的峰电流响应的影响。如图8所示，当pH值从3.0增加到4.5，还原峰电流也随之增加； pH值继续增加，还原峰电流反而减小，在pH 4.5时，免疫传感器的电流响应值最大。故选择pH 4.5的HAc.NaAc缓冲溶液作为最佳测试底液。

3.4.2 固定抗体的浓度对传感器峰电流的影响 固定抗体浓度是影响免疫传感器灵敏度和检测范围的重要因素，实验对固定抗体浓度进行了优化，浓度优化范围为10～60 μg/mL，结果如图9所示，随着固定抗体浓度增大，传感器的响应电流逐渐增大，当抗体浓度达到30 μg/mL时，响应电流最大，继续增大浓度。响应电流有所减小。因此选择30 μg/mL作为最佳固定抗体浓度。

3.4.3 抗原培育时间和标记抗体培育时间对传感器峰电流的影响 为了考察抗原培育时间对免疫传感器响应电流的影响，采用不同时间培育10 ng/mL CEA抗原， 测定传感器的响应电流值，结果如图10a所示， 响应电流随抗原培育时间延长而增大，50 min以后响应电流近似平台，因此选择50 min作为最佳抗原培育时间。标记抗体培育时间也是影响免疫传感器的重要因素，将修饰有相同浓度抗原的免疫传感器在37℃的条件下采用不同时间培育标记抗体，结果如图10b所示， 20～50 min，传感器响应电流的绝对值随着培育时间的延长而逐渐增大； 50～60 min， 电流基本不变，出现平台，说明此时CEA抗原和AuNPs/Cu.TPA标记的CEA抗体结合形成了稳定的复合物。因此，最佳标记抗体的培育时间选择为50 min。

3.5 免疫传感器的校正曲线 在最佳实验条件下，获得了传感器对不同浓度的CEA响应的曲线。从图11可见，AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫传感器的峰值电流随CEA浓度的增加而增大，峰电流在0.1～80 ng/mL范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.9887，检出限为0.03 ng/mL， 正常人体内CEA含量为0～25 ng/mL， 所以此CEA免疫传感器可用于真实样品的检测。

比较了几种检测CEA方法的性能。从表1可知，本研究制备的传感器具有较高的灵敏度、良好的线性范围和较低的检出限。

3.6 免疫传感器的选择性

选择200 ng/mL的丙氨酸（Ala）、C.反应蛋白（CRP）和人绒毛促性腺激素（HCG）以及BSA（1%）作为干扰物质，与40 ng/mL CEA的响应电流作对比，检测传感器的抗干扰情况。如图12所示，在相同条件下，丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG的浓度远大于CEA，但所得响应电流较小，说明丙氨酸、BSA（1%）、CRP和HCG对CEA的检测基本不造成干扰，传感器对CEA具有较高的选择性。

3.7 回收率的测定

采用标准加入法，对CEA免疫传感器进行回收测定。在血清样品中加入3种不同浓度的

CEA抗原，按本方法进行测定，平均回收率为97.5%～102.7%（表2），结果令人满意，说明此传感器可用于实际样品中CEA含量的测定。

3.8 免疫传感器的稳定性

为了考察免疫传感器的稳定性，将所制备的免疫传感器检测一次后置于4℃保存，分别在7、15、30天后再次对相同浓度的CEA抗原进行检测， 测得的电流I与初始电流I0的比值7天后下降到98%，15天后下降到87%，30天后下降到66%， 表明此传感器的稳定性良好。4 结 论

采用还原石墨烯作为固定基质，研制了一种新型CEA免疫传感器，并用于血清中CEA的检测。合成了Cu.TPA/AuNPs复合材料，此材料中的Cu在一定的电位范围内可以通过DPV直接检测到，以Cu.TPA/AuNPs复合纳米材料为标记材料，制备了夹心型CEA免疫传感器。此传感器具有成本低、灵敏度高，抗干扰能力强，检出限低等特点。将此传感器用于测定血清样品中的CEA，结果令人满意。

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Abstract A novel and simple electrochemical immunoassay for carcino.embryonic antigen （CEA） was developed using Au nanoparticles loaded.metal.organic frameworks （AuNPs/Cu.TPA） as signal unit and electrochemical reduction of graphene oxide on the surface of electrode to capture CEA antibody （Ab1）. MOFs contain large amounts of Cu2+ ions， which can be used as stable electrochemical signals to achieve the detection of CEA. This new class of signal probe differs from traditional probe because it does not require pre.treatment and acid treatment， and easy to load noble metal for the immobilization of antibody， which will greatly simplify the detection steps and reduce the detection time. This immunosensor has good sensitivity and ease to operate. Under the optimized experimental conditions， the proposed sensing strategy provides a linear dynamic range from 0.1 ng/mL to 80 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL and linear correlation coefficient of 0.9887. The developed CEA immunosensor can be used to detect CEA in real sample.

Keywords Carcino.embryonic antigen； Metal organic framework； Electrochemical immunosensor