针康法对脑缺血大鼠神经功能和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响①

唐强，叶涛，朱路文，吴孝军，李宏玉，田源

针康法对脑缺血大鼠神经功能和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响①

唐强1，叶涛2，朱路文1，吴孝军2，李宏玉2，田源2

目的探讨针康法对脑缺血大鼠神经功能预后和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法90只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入假手术组(n=18)、模型组(n=18)、针刺组(n=18)、康复组(n=18)及针康组(n=18)，再分为术后3 d、7 d、14 d三个亚组(n=6)。线栓法制备永久性局灶性脑缺血模型。假手术组和模型组不进行治疗，针刺组采用头穴丛刺针法治疗，康复组给予电动跑台训练，针康组采用针康法治疗。各时间点，采用改良神经损害严重程度评分进行评定，Western blotting法检测缺血半暗区皮层ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。结果术后各时间点，与模型组比较，各治疗组神经缺损评分降低(P＜0.05)；术后7 d、14 d，与针刺组、康复组比较，针康组评分降低(P＜0.05)。术后各时间点，与模型组比较，各治疗组p-ERK1/2蛋白表达增加(P＜0.05)，(p-ERK1/2)/(ERK1/2)增加(P＜0.05)；与针刺组、康复组比较，针康组p-ERK1/2蛋白表达升高(P＜0.05)，(p-ERK1/2)/ (ERK1/2)增加(P＜0.05)。结论针康法治疗可进一步改善脑缺血大鼠神经行为，可能与ERK1/2信号通路激活有关。

脑缺血；针康法；神经功能；细胞外信号调节激酶1/2；大鼠

[本文著录格式] 唐强，叶涛，朱路文，等.针康法对脑缺血大鼠神经功能和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(1):27-31.

CITED AS:Tang Q,Ye T,Zhu LW,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and extracellular sig-nal-regulated kinase 1/2 signaling pathway after focal cerebral ischemia in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(1):27-31.

缺血性脑卒中是由于动脉狭窄或闭塞，脑血流供应障碍造成大脑缺血、缺氧，最终导致局限性脑组织坏死的总称，占全部脑卒中的60%～80%，发病率、死亡率、致残率居高不下，并呈现年轻化趋势[1]。针康法已经广泛运用于脑卒中患者各类功能障碍的治疗，临床疗效显著，安全性和有效率得到大量临床与基础研究证实[2]。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase1/2,ERK1/2)信号通路与脑缺血再灌注损伤修复关系密切[3-4]。本研究观察针康法对脑缺血大鼠神经功能及ERK1/2信号通路的影响，探讨针康法神经保护作用的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，初始体质量(250±20)g，鼠龄10～12周，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证书编号SYXK(黑) 2010007。饲养条件：温度23～25℃，湿度55%～65%，12 h/12 h明暗交替。实验前所有大鼠经适应性喂养1周及适应性跑台训练3 d(速度15 m/min，每天30 min)后，筛选可完成跑台训练方案的大鼠90只。实验过程中大鼠处置严格遵守动物伦理准则和指南的相关规定。

将90只大鼠编号，计算机生成含90个数的随机数字表，任意选择表中一个数为起始点对应大鼠编号1，从左至右，自上而下分别对应1～90号大鼠。用随机数字除以5得余数确定每只大鼠的分组，余数0、1、2、3、4分别对应假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组，最终各组均有18只大鼠；同法将各组18只大鼠再分入3 d、7 d、14 d三个亚组(n=6)。

造模失败或死亡大鼠另选大鼠补充。

1.2 实验试剂与仪器

ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗体：SANTA CRUZ公司。β-actin抗体：WANLEIBIO公司。羊抗兔IgG-HRP：BEYOTIME公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。TEMED：AMRESCO公司。预染蛋白分子量标准：FERMENTAS公司。

汉医牌一次性无菌针灸针：北京汉医医疗器械中心。Research plus移液器：EPPENDORF公司。ZH-PT型动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司。Multiskan FC型酶标仪：THERMO公司。KDC-140HR高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。Smart Simplicity型超纯水系统：MERCK公司。DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪、DYCZ-40D型转印电泳仪、DYY-7C型电泳仪电源、WD-9405B型脱色摇床：北京六一仪器厂。BIS910凝胶成像分析系统：北京东胜创新生物科技有限公司。

1.3 模型制备

参考Longa法[5]及前期实验研究[6]，制备大脑中动脉永久性脑缺血大鼠模型。大鼠术前12 h禁食。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，术中动物保持自主呼吸，恒温加热板维持体温(37.0±0.5)℃。颈部备皮，碘伏消毒后颈正中切口，暴露大鼠右颈总、颈外及颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，用微动脉夹阻闭分叉处血流，在其下方3～5 mm处用2 ml注射器针头斜刺一个“V”型小口，将头端2 mm过蜡，长3 cm的鱼线送入血管，备活结以固定线栓；松开动脉夹，将鱼线送入颈内动脉，阻断大脑中动脉血流。将活结扎死以固定线栓。消毒，逐层缝合。

假手术组大鼠不插入线栓，其余操作相同。

术后1 d，采用Longa 5级4分制标准[5]筛选模型，评分1～3分大鼠纳入实验。

1.4 干预方法

假手术组及模型组术后回笼饲养，不进行任何治疗，只给予同等条件抓取。

针刺组于术后24 h，采用头穴丛刺针法治疗。直径0.25 mm、长25 mm一次性针灸针，取百会穴及其左、右各旁开2 mm处针刺，快速捻转1 min后留针2 h，每天1次。

康复组于术后24 h，采用电动跑台训练模拟运动康复治疗。坡度0°；速度：第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，第7天后15 m/min。每次30 min，每天1次。

针康组于术后24 h，采用头穴丛刺结合跑台训练进行治疗，让大鼠在头穴丛刺针留针期间完成跑台训练。头穴丛刺方案同针刺组，跑台训练方案同康复组。

1.5 神经行为学评估

术后各时间点，各组大鼠干预结束后，采用改良神经损害严重程度(modified Neurologic Severity Score, mNSS)[7]评估各组大鼠神经功能恢复情况。

1.6 Western blotting

术后各时间点，神经功能评分后，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，冰板上快速断头取脑，采集大脑中动脉梗死周边皮层缺血组织，液氮速冻5 min后，-80℃冰箱中冻存备用。

取一定量标本，加入细胞裂解液制成蛋白匀浆，低温孵育后提取上清液。BCA法测定上清液中蛋白质总浓度。上样体积20 μl，含蛋白50 μg。10% SDS-PAGE电泳分离目的蛋白(80 V，2.5 h)，转移到PVDF膜上(70 V，1.5 h)。TTBS缓冲液配制5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，加入ERK1/2(1∶200)、p-ERK1/2(1∶200)一抗，4℃孵育过夜。加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，室温孵育1 h。TBST洗膜，加入ECL发光孵育5 min，显影，凝胶成像仪上照相，Gel-Pro Analyzer 4.0进行定量分析。以假手术组某一样本蛋白相对表达量为1，其余样本均为与其较正后的相对表达量。

1.7 统计学分析

应用SPSS 22.0进行统计分析。mNSS评分和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量及(p-ERK1/2)/ (ERK1/2)比值均以(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 mNSS

各时间点，假手术组mNSS评分均为0；与假手术组比较，模型组评分升高(P＜0.05)；与模型组比较，各治疗组评分降低(P＜0.05)。术后7 d、14 d，与康复组、针刺组比较，针康组mNSS评分降低(P＜0.05)。见表1。

表1 各时间点各组大鼠mNSS评分比较

2.2 Western blotting

术后3 d、7 d，模型组p-ERK1/2蛋白水平较假手术组下降(P＜0.05)，术后14 d上升(P＜0.05)。与模型组比较，各治疗组各时间点p-ERK1/2蛋白水平升高(P＜0.05)。与针刺组、康复组比较，针康组p-ERK1/2蛋白水平进一步升高(P＜0.05)；针刺组与康复组也有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

表2 各时间点各组大鼠p-ERK1/2蛋白相对表达量比较

术后3 d、7 d，各组间ERK1/2蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)。术后14 d，针康组ERK1/2蛋白表达上升(P＜0.05)。见表3。

术后3 d、7 d，模型组(p-ERK1/2)/(ERK1/2)较假手术组降低(P＜0.05)，术后14 d升高(P＜0.05)。与模型组比较，各治疗组各时间点(p-ERK1/2)/(ERK1/2)升高(P＜0.05)，针康组较针刺组、康复组升高(P＜0.05)；术后3 d、7 d，针刺组较康复组下降(P＜0.05)。见表4。

表3 各时间点各组大鼠ERK1/2蛋白相对表达量比较

表4 各时间点各组大鼠(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比较

3 讨论

针康法作为脑卒中康复的新方法，集头穴丛刺疗法与现代康复于一体，具有“针康同步、动态治疗、整体康复”的优势，被广泛运用于脑卒中患者运动、平衡、言语、认知等功能障碍的康复，可明显改善其功能，提高日常生活活动能力，优于单纯头穴丛刺或康复[8-11]。针康法可改善脑缺血大鼠神经功能，减轻脑水肿，缩小脑梗死体积，促进运动功能恢复等，机制涉及突触可塑性、神经再生、血管新生、细胞凋亡及炎症级联反应等多个环节[12-15]。

mNSS从运动、感觉、反射三个方面评定神经功能。本研究显示，针康法可以加速神经功能恢复，优于单纯头穴丛刺或康复，且远期功能恢复更佳。

ERK信号传导通路是主要的细胞存活和增殖信号途径之一，与缺血性脑卒中关系密切，但目前对其发挥保护作用还是损害作用尚存有争议[4,16]。大量研究肯定ERK1/2通路的激活对缺血性脑卒中有保护作用：脑缺血后上调p-ERK蛋白表达可发挥抗炎作用，降低脑梗死体积，减轻脑水肿[17]；促进骨桥蛋白分泌，降低兴奋性氨基酸毒性，促进小胶质细胞存活[18]；激活缺氧诱导因子-1α表达，对抗缺氧性脑损伤，发挥神经保护作用[19]等。作为有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)的一个主要亚家族，正常情况下ERK位于胞质内，细胞因子、生长因子、G蛋白偶联性配体、射线、渗透压改变及微管解体等细胞内外刺激因素，均可通过Raf-MEK-ERK途径，磷酸化ERK1/2Ⅷ区上丝氨酸/苏氨酸双位点，从而激活ERK；活化的ERK(p-ERK)能将胞外刺激信号传递至胞核，调控转录因子、细胞骨架蛋白及蛋白激酶等表达，调节细胞存活、增殖、分化、凋亡及组织侵袭等多种生物学效应[3]。电针可促进脑缺血后细胞增殖，发挥脑保护作用，其机制与激活ERK信号通路有关[20]。

本研究显示，脑缺血后，p-ERK1/2蛋白表达呈现先降后升趋势，原因可能是由于急性缺血缺氧环境造成ERK1/2途径激活失败；随着损伤程度减弱，ERK1/2信号通路活性逐渐增强。随着治疗手段介入，p-ERK1/2蛋白表达大致呈现先升后降趋势，在较长时间内维持ERK1/2信号途径活化；其中，针刺后p-ERK1/2蛋白表达高峰低于康复，但可持续较长时间；针康治疗后，p-ERK1/2蛋白表达则呈持续升高趋势，且表达水平始终高于单一的针刺或康复治疗。值得注意的是，干预后期针康法上调ERK1/2蛋白的表达水平，具体机制仍需进一步研究阐明。

综上所述，针康法治疗后，脑缺血大鼠神经功能明显改善，可能与其激活ERK1/2信号通路有关。但具体激活途径，以及激活后的作用途径仍有待进一步研究。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Neurological Function and Extracellular Signal-regulated Kinase 1/2 Signaling Pathway after Focal Cerebral Ischemia in Rats

TANG Qiang1,YE Tao2,ZHU Lu-wen1,WU Xiao-jun2,LI Hong-yu2,TIAN Yuan2
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

ObjectiveTo explore the effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function recovery and extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)signaling pathway activation after permanent focal cerebral ischemia in rats.MethodsNinty male Sprague-Dawley rats were divided into five groups,namely sham group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation group,and 18 in each group.Each group was further divided into 3 days,7 days and 14 days subgroups(n=6).Their middle cerebral arteries were occluded except those of sham group.The sham and model groups accepted no treatment,while the acupuncture group accepted cluster needling of scalp acupuncture,rehabilitation group accepted treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation group accepted both acupuncture and treadmill training.They were assessed with modified Neurologic Severity Score(mNSS)3,7 and 14 days after modeling,while the expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 were determined with Western blotting.ResultsThe neurologic severity score reduced in all three treatment groups(P＜0.05)compared with that of the model group at every time point,and was the least in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05)7 and 14 days after modeling among the treatment groups.Meanwhile,the expression of p-ERK1/ 2 increased in all three treatment groups(P＜0.05),and was the most in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05),as well as the rate of (p-ERK1/2)/(ERK1/2)(P＜0.05).ConclusionAcupuncture-rehabilitation therapy can promote the neurological function recovery,which may be associated with activation of ERK1/2 signaling pathway.

cerebral ischemia;acupuncture-rehabilitation therapy;neurological function;extracellular signal-regulated kinase 1/2;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.01.007

R743.3

A

1006-9771(2017)01-0027-05

2016-10-10

2016-10-31)

1.国家自然科学基金项目(No.81273818;No.81473762)；2.黑龙江中医药大学领军人才计划项目(No.2012RCL02)。

1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040。作者简介：唐强(1963-)，男，汉族，四川大竹县人，博士，教授，主要研究方向：神经系统疾病中医康复基础与临床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。