基于PCR—DGGE的间作油茶林土壤细菌多样性

文亚雄��+刘君昂��+刘小平��+周国英��

摘要：土壤微生物多样性是评价土壤质量的重要指标，为探究林农间作对油茶林土壤微生物多样性的影响，采用PCR-DGGE方法研究了油茶林间作大豆、间作花生2种间作模式不同时期对油茶林土壤细菌多样性的影响。结果表明：间作处理各时期的土壤微生物种群相似性、微生物多样性指数均高于对照处理；间作处理微生物多样性指数保持在3.2～3.4之间；间作处理各时期土壤微生物均匀度指数为0.960～0.982；各处理的微生物种群相似性、微生物多样性指数与季节变化相关。

关键词：油茶林；林农间作；土壤微生物；多样性

中图分类号： S154.38+1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0057-03

林农间作是指将多年生木本植物通过空间或时间布局与农作物合理安排在同一土地经营单位内，使其中各组分在生态和经济上具有相互作用[1]。研究表明，间作能显著提高土壤微生物的生物量[2]，改变土壤微生物群落结构，提高土壤微生物的群落结构多样性[3-4]，对土壤有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等过程[5]也有促进作用。间作豆科植物还能通过生物固氮提高土壤氮素水平、增加产量[6-7]。目前，关于林农间作的研究大多关于间作系统中的物理因素，如间作对林下小环境中光、热、水[8-9]、土壤养分[10]的影响，而关于间作体系中土壤微生物多樣性的研究较少，对油茶林土壤微生物多样性的研究未见报道。

油茶是世界四大木本油料植物之一，是我国特有的木本油料植物，广泛分布于我国南方地区[11]。近年来，随着市场需求的发展及国家对油茶产业的支持，油茶逐渐成为我国南方地区的一种重要经济作物。

通过对间作大豆、花生油茶林根区（距植物根系0～20 cm）土壤微生物多样性进行对比研究，探讨间作大豆、花生对油茶根区土壤微生物多样性的影响，以期为提高油茶林间套作生产的经济效益提供依据。

1材料与方法

1.1试验设计

试验于江西省宜春市袁州区西村镇（27°44′9.83″N，114°11′24.32″E）油茶基地进行，该地属于中亚热带季风气候区，具有四季分明、热量丰富、降水充沛、日照充足、霜期短、气候资源丰富等特点，有利于农作物和林木生长。试验地的年均日照时数约为1 737.1 h，年均气温为16.2～17.7 ℃，年均降水量约为1 624.9 mm，日均温度≥10 ℃的活动积温为 5 050～5 644 ℃。试验地土壤为红壤，地力均匀，便于排灌。

试验处理包括间作花生、间作大豆、无处理对照。试验用油茶林为4年生油茶幼林，株行距为2 m×3 m，长势良好。

处理1：于造林后1年开始每年间种大豆，本研究中于2014年4月底间种，于同年7月收获，收获后将大豆苗覆于样地。处理2：于造林后1年开始每年间种花生，本研究中于2014年5月间种，于同年8月收获，收获后将花生苗覆于样地。CK处理：选取1块纯林样地作为无处理对照。

1.2林间取样

本研究分别采集间作花生油茶林、间作大豆油茶林、对照纯林间作植物收获时及收获后的土壤样品，间作大豆、间作花生处理第1次采样时间分别为7、8月，收获后第2次采样时间分别为8、10月。每个处理在样地内以对角线法选取5株油茶，采集油茶根区（距油茶根系0～20 cm）表层0～20 cm土壤样品，采集后混合。

将林间取得的土样放入冰盒保存，带回实验室后迅速过2 mm土筛，除去杂物。将过筛土样于-20 ℃下保存，用于土壤微生物群落结构的研究。

1.3.3土壤微生物多样性的DGGE图谱分析

使用Bio-Rad DCode Universal Mutation Detection System电泳系统进行DGGE分析。采用浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为45%～65%（100%变性浓度为100 mL聚丙烯酰胺凝胶中加入40 mL去离子甲酰胺与42 g尿素），每孔加样为25 μL PCR产物、5 μL 6×loading buffer，于60 ℃恒温条件下[JP3]在1×TAE缓冲液中100 V电泳10 h。电泳完成后银染照相。

1.4数据分析

采用Quantity one软件识别PCR-DGGE图谱中的泳道及条带，得出量化图及相应数据，进行数学未成对加权聚类分析（UPGMA），计算物种均匀度、Shannon-Wiener多样性指数。Shannon-Wiener指数（H）、均匀度（E）的计算公式为：

[HS+7mm][JZ]H=-∑[DD（]s[]i=1[DD）]PilnPi；E=H/lnS。

式中：Pi为第i条条带的优势度，S为样本的总条带数[12]。

2结果与分析

2.1PCR产物琼脂糖电泳检测

所有样品最终PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1）显示，该PCR方法能较好地扩增目标片段，目标片段长度约为200 bp，无非特异性扩增及引物二聚体，可用于后续DGGE分析。

2.2DGGE图谱分析

对不同间作模式油茶林土壤微生物的16S rDNA V3可变区进行DGGE图谱分析，结果（图2-a）表明，各DGGE泳道内条带被较好地分离，不同间作模式土壤微生物DNA条带表现出不同的指纹图谱及灰度，不同样品的细菌群落表现出一定差别。由DGGE结果量化图（图2-b）可知，不同样本的条带分别与同批次样本间有较多相同，表明相同样地内具有较多的共有微生物种群。该类微生物应是土壤中的常见微生物种群，在土壤中的生长繁殖较为稳定，但该类微生物DNA条带灰度不尽相同，表明间作处理对土壤微生物的数量也有一定影响。间作处理的条带数量基本多于对照处理，表明间作处理增加了土壤中微生物的种群数量。 [FL）]

[FL（2K2]2.3DGGE图谱聚类分析

以非加权算术平均法（UPGMA）对不同间作模式油茶林土壤细菌DNA的DGGE指纹图谱进行聚类分析。结果（图3）表明，季节变化对土壤微生物多样性的影响较大，不同季节各处理间的相似性均低于0.60，相似性水平较低。间作花生与间作大豆处理的相似性较高，第1、2次采样的相似性均为0.48，第3次采样的相似性为0.39，表明间作花生与间作大豆对土壤微生物多样性的影响具有一定相似性。在3个不[JP3]同采样时间之间，间作处理的相似性均聚于0.39，高于对照处理间的相似性，表明间作处理能提高土壤微生物种群的稳定性。

2.4土壤微生物多样性指数分析

根据由Quantity one软件得出的不同条带光密度峰值，运用Shannon-Wiener指数公式，计算得出不同间作处理土壤微生物多样性指数。由图4、图5可知，间作处理的土壤微生物多样性指数基本高于对照处理，其中间作花生处理第1次采[CM（25]样的多样性指数最高，达3.463；各处理的多样性指数与季[CM）]

节变化相关，由春季向冬季逐渐降低。间作处理第1次采样的多样性指数与对照处理相近，均处于3.3～3.5之间；间作处理第2、3次采样的多样性指数略有降低，但仍处于3.1以上，而对照处理下降较多，降至3.0以下，间作处理在后期对土壤微生物多样性的影响较大。间作处理的微生物群落均匀度变化较大，表明间作植物处理对油茶林土壤微生物群落结构的影响较大。间作花生处理各时期的多样性指数均高于间作大豆处理，表明间作花生对土壤微生物多样性的影响较大。

3结论与讨论

土壤微生物是土壤生态系统的主要组成部分，对土壤肥力、酶活性[13]、土壤结构等有着重要影响。合理的间作可有效改善土壤微生态环境，提高土壤微生物的群落结构多样性，并对土壤理化性质产生影响。陈永忠等、王瑞等研究表明，间作能提高油茶林土壤养分及微生物数量[14-15]。张向前等在研究玉米与花生、大豆间作时发现，间作能显著提高土壤中的微生物数量，且微生物数量与土壤中酶活性呈显著正相关关系[16]。本研究结果表明，不同间作处理均能提高土壤微生物种群多样性，对土壤微生物数量也有一定影响。

王玉娟等研究表明，稻草覆盖能有效调节土壤温度，具有高温季节降温、低温季节增温的效果，并能改善土壤理化性质[17-18]。徐华勤等研究发现，稻草覆盖与间作三叶草处理均可提高土壤微生物的活性与丰富度[19]。在本研究间作豆科植物处理中，豆科植物收获后将植物残体覆盖于林间土地，不仅起到了夏季降温、冬季保温的作用，且随着植物残体的分解，较多的有机质及营养元素流入土壤中，为微生物的生长繁殖提供了有利条件，使间作豆科植物处理的微生物种群相似性及微生物多样性指数始终保持在较高水平。另外，间作植物本身伸展的枝叶也覆盖了地面，可起到降温作用。

随着微生物多样性水平及种群数量的提高，油茶林土壤肥力也受到了影响。贾倩民等研究发现，细菌及放线菌数量与土壤有机质、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量呈显著或极显著正相关，真菌数量与土壤全钾、速效磷、速效钾含量呈极显著正相关[20]。邵英男等认为，N、P含量及土壤pH值与细菌和放线菌的数量呈显著正相关[21]。本试验数据表明，间作花生并于花生收获后将花生秸秆覆盖于林下土地的林农复合经营模式，对调控油茶林土壤微生物多样性具有较为积极的作用，同时对油茶林土壤肥力具有较好的影响，可在一定程度上促进油茶幼林的生长。

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